1.3.2.3 .Công thức phối trộn cơ chất
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng các phương pháp nấm học trong nghiên cứu hình thái quả thể, bào tử, hệ sợi và nghiên cứu tốc độ mọc của hệ sợi nấm (Trịnh Tam Kiệt, 1981, 1986)
[4], [7]. Sử dụng phương pháp nuôi trồng thực hiện theo “Công nghệ nuôi trồng nấm ăn và nấm dược liệu”[8].
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy đánh giá tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Linh chi trên môi trường thuần khiết. chi trên môi trường thuần khiết.
Bảng 2.1: Thành phần các mơi trường thuần khiết (g/lít)
Nguyên liệu Môi trường Khoai tây Bột ngô Cám
gạo Pepton KH2PO4 Glucose Agar
I (ĐC) 200 20 20
II 200 20 20 2 1 20 20
III 200 20 20 20 20
Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch,cắt thành từng lát dày 1,5 - 2 cm, cho vào nồi, bổ
sung nước, đun sôi (10 - 15 phút) đến khi khoai nhừ nhưng không bị nát tung ra là
được, lọc lấy nước chiết.
Bột ngơ và cám gạo hịa vào nước ấm (40 - 450C), lọc lấy nước trong.
Trộn 2 dịch chiết trên với nhau, bổ sung nước cho đủ 1000 ml. Sau đó thêm
pepton, agar, các ngun tố khống; đun sơi đến khi agar tan hết, vớt sạch bọt, bổ sung glucose vào, khuấy khoảng 1 phút là được (thành phần các chất như bảng 2.1).
Môi trường trên được đổ vào bình tam giác 250ml, mỗi bình đổ 100ml, khử trùng ở
nhiệt độ 1210C (1atm) trong 55 phút. Sau khi khử trùng, để nguội cho đông thạch
rồi tiến hành cấy giống, theo dõi tốc độ mọc của sợi.
Mỗi bình cấy một miếng giống gốc có đường kính khoảng 4mm, ni ở
phịng có nhiệt độ 25 - 270C. Hàng ngày theo dõi tốc độ mọc của sợi, đặc điểm hệ
sợi của nấm Linh chi trong các công thức mơi trường trên. Mỗi thí nghiệm lặp lại 5 lần.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH, nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng của sợi nấm Linh chi trưởng của sợi nấm Linh chi
Thí nghiệm thu sinh khối của hệ sợi nấm Linh chi được nuôi cấy trong môi
trường lỏng. Sử dụng Cơng thức II để tiến hành thí nghiệm: 20g bột ngô + 20g cám
gạo + 2g pepton + 1g KH2PO4 + 20g glucose + 1000ml nước cất.
Cách chuẩn bị môi trường giống như phần 2.3.1 không bổ sung thạch.
2.3.2.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Linh chi sợi nấm Linh chi
Đổ mơi trường vào bình tam giác thể tích 250 ml, mỗi bình đổ 100 ml
Điều chỉnh pH môi trường ở các mức khác nhau từ 3-8 bằng dung dịch HCl
1M và NaOH 1M. Khử trùng ở nhiệt độ 1210C (1atm) trong 55 phút, kiểm tra lại
pH môi trường sau khi khử trùng. Để nguội mơi trường rồi tiến hành cấy giống. Mỗi bình tam giác cấy 3 miếng giống gốc, mỗi miếng có đường kính khoảng
độ lắc 110 vịng/phút.
Kết thúc q trình ni sợi, ly tâm dung dịnh nuôi cấy để tách sợi nấm, sấy khô sợi nấm đến khối lượng không đổi. Khối lượng sợi khơ được tính bằng mg/100ml dịch nuôi.
2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng của nấm Linh chi. của nấm Linh chi.
Cấy vào mỗi bình tam giác (250 ml) chứa 100 ml môi trường lỏng đã được khử trùng 3 miếng giống gốc có đường kính khoảng 4 mm, đem giống ni trên máy lắc có tốc độ lắc 110 vịng/phút ở các nhiệt độ khác nhau: 200C, 250C, 300C, 350C. Thời gian nuôi sợi khoảng 7 ngày.
Kết thúc q trình ni sợi, ly tâm dung dịch nuôi cấy để tách sợi nấm, sấy khô sợi nấm đến khối lượng không đổi. Khối lượng sợi khơ được tính bằng mg/100ml dịch nuôi.
2.3.3. Phương pháp đánh giá tốc độ sinh trưởng và đặc điểm hệ sợi trong môi trường nhân giống cấp 2. trường nhân giống cấp 2.
Giống cấp hai được nhân chuyển từ giống cấp một và được sử dụng làm giống nuôi trồng.
Môi trường nhân giống cấp hai có thành phần chính là thóc luộc nứt vỏ, mùn
cưa đã qua xử lý có độẩm 65-68% và bổ sung một số phụ gia khác.
Bảng 2.2: Thành phần môi trường nhân giống cấp hai
(tỷ lệ % khối lượng)
Ngun liệu Cơng thức
Thóc luộc Mùn cưa Cám ngô Cám gạo CaCO3
CT 1 CT 2 CT 3 99 69 30 79 10 10 1 1 1
Thóc: cần chọn thóc tẻ loại có chất lượng tốt, cùng chủng loại, kích thước hạt
đồng đều, nên chọn loại thóc có ít nhựa (khi luộc khơng bị nát). Thóc ngâm khoảng
12h, đãi sạch, loại bỏ thóc lép bằng cách gạn rửa nhiều lần, luộc đến nứt vỏ, đổ ra rổ làm nguội thật nhanh tránh làm nát thóc.
Mùn cưa ủ bằng nước vôi trong 1% (pH = 12), đạt độ ẩm 65-68% trong 24h.
Phối trộn nguyên liệu như bảng 2.2.
Các công thức sau khi phối trộn, đóng vào chai thủy tinh có kích thước
7x12cm. Khử trùng ở nhiệt độ 1210C (1atm) trong 90 phút, để nguội rồi cấy giống.
Nuôi sợi ở nhiệt độ 24-270C, phịng ni cần thơng thống, ít ánh sáng.
Các chỉ tiêu theo dõi:tỷ lệ nhiễm, tốc độ phát triển sợi, đặc điểm hệ sợi.
2.3.4. Phương pháp đánh giá sự sinh trưởng của hệ sợi và sự hình thành quả thể nấm Linh chi trên giá thể nuôi trồng. nấm Linh chi trên giá thể nuôi trồng.
Mùn cưa bồ đề hoặc mùn cưa các loại gỗ khơng có tinh dầu, khơng bị mốc, khơng dính dầu máy, được làm ẩm bằng nước vôi trong 1%, ủ trong 24h, độ ẩm nguyên liệu sau ủ đạt 65 - 67%. Tiến hành phối trộn mùn cưa đã xử lý với các
nguyên liệu bổ sung khác theo tỷ lệ: 83,5% mùn cưa + 7% bột ngô + 8% cám gạo +
0,5% đường sacharose + 1% CaCO3. Đây là công thức môi trường chuẩn đang được
áp dụng để sản xuất tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Thực vật.
Toàn bộ cơ chất phối trộn được đóng vào bịch có kích thước 25x 35cm, khối
lượng khoảng 1,4 - 1,6kg, khử trùng bằng nồi autoclave ở 1,2 - 1,5 atm trong thời
gian 2,5 giờ. Để nguội rồi tiến hành cấy giống. Chuyển bịch vào trong phịng ni
cho đến khi sợi lan được 1/2 - 2/3 bịch nấm thì tiến hành nới nút bơng cho nấm mọc
qua cổ nút rồi chuyển bịch vào nhà nuôi trồng.
Các chỉ tiêu theo dõi gồm: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi, nhiệt độ và thời
2.3.5. Phương pháp nuôi trồng nấm Linh chi
2.3.5.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất phối trộn và phương pháp khử trùng đến tỷ lệ nhiễm bệnh đến tỷ lệ nhiễm bệnh
Mùn cưa bồ đề hoặc mùn cưa các loại gỗ khơng có tinh dầu, khơng bị mốc, khơng dính dầu máy, được làm ẩm bằng nước vơi trong 1%, ủ trong 24h, độ ẩm nguyên liệu sau ủ đạt 65 - 67%. Tiến hành phối trộn mùn cưa đã xử lý với các nguyên liệu bổ sung khác theo bảng 2.3.
Bảng 2.3: Thành phần môi trường cơ chất phối trộn (% khối lượng)
Thành phần
Công thức
Mùn cưa Bột ngô Cám gạo Saccarose CaCO3
I (ĐC) 83,5 8 7 0,5 1
II 88,5 5 5 0,5 1
III 81,5 9 9 0,5 1
IV 78,5 10 10 0,5 1
Toàn bộ nguyên liệu được phối trộn đồng đều, tiến hành đóng túi 25 x 35cm,
khối lượng 1,4 - 1,6 kg rồi đem khử trùng. Bịch được khử trùng bằng lị thủ cơng
trong 6h và khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở áp suất 1,2 - 1,5at/ 2,5h.
Sau khi khử trùng để nguội bịch, tiến hành cấy giống, chuyển bịch sang khu
vực ni sợi ở phịng có nhiệt độ từ 25 - 270C, phịng cần thơng thống và khơng
cần ánh sáng. Trong thời gian nuôi sợi phải thường xuyên kiểm tra loại bỏ bịch nhiễm.
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ nhiễm, nguyên nhân nhiễm.
2.3.5.2. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất đến một số chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất nấm Linh chi. suất nấm Linh chi.
chủng cấy 150 bịch từ 3 - 5 lần lặp lại. Cấy xong chuyển sang khu vực ni sợi ở phịng có nhiệt độ từ 25 - 270C. Khi sợi lan được 1/2 - 2/3 bịch nới nút bông cho ra quả thể rồi chuyển sang khu vực chăm sóc, thu hái quả thể.
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ nhiễm
- Thời gian lan sợi 50% bịch, 100% bịch
- Thời gian ra quả thể
- Năng suất nấm (Khối lượng nấm khô/ tấn nguyên liệu khơ)
2.3.6. Phương pháp xác định thành phần hóa học
- Protein tổng số được xác định theo ISO 5983 - 1997 - Glucid tổng số được xác định theo AOAC - 1990
- Lipid tổng số được xác định theo phương pháp Soxlet ISO 6492 - 1999
- Thành phần, hàm lượng axit amin được xác định trên máy phân tích tự
động Hp - amino Quant series II