- Hạch nấm cĩ trong nhiều chủng, màu nâu xám tới màu
việc phát triển phương pháp đồng phân cột (Stephand, 1984).
đ) Phương pháp cột mini (Minicolunn methods)
Phương pháp cột mini nhằm xác định nhanh Aflatoxin cĩ trong mẫu. Phương pháp này đơn giản, ít tốn kém, nhưng chỉ
xác định định tính.
Kỹ thuật cột mini là cột sắc ký bằng thủy tỉnh hay chất
dẻo cĩ kích thước khoảng 3-6mm chiều rộng và 20cm chiều dai. Dung dich chiết tách được làm sạch bằng dung mơi/dung mơi và hịa tan trong một luong nhé benzen hay chloroform.
Cột được nhồi Silica gel như một chất hấp thụ và quan sắt
dưới ánh sáng tử ngoại (UV) để xác định màu huỳnh quang
xanh chỉ ra sự cĩ mặt của Aflatoxin.
Nhiều tác giả như Davis và cộng SỰ (1981), Holaday
(1976), Holaday va Lansden (1975) da cai tién phuong phap này nhằm phát hiện nhanh Afiatoxin trong mẫu. Phương pháp
cột mini của Romes (1975) da duoc A.O.A.C (Association of
Offical Analytical Chemists) (1980) cơng nhận. Aflatoxin được tách bằng axeton và nước (85:15), các chất tạp được loại trên gel cacbonat đồng và chloric sắt. Sau đĩ, Aflatoxin được
tách ra bằng một pha nước với chloroform. Chloroform tách được đưa vào cột cĩ chứa một lớp bột nhơm trung tinh, silica gel và florisil ở phía dưới, sunfat canxi khơ ở cả trên và đưới.
Cột được chạy trong chloroform va axeton (9:1) để giữ
Aflatoxin trên đính của lớp floriil. Ở đĩ Aflatoxin cĩ thể được xác định bởi mầu huỳnh quang xanh dưới đèn tử ngoại.
Hiện nay cắc cột mini được sản xuất và bán thị trường
(Myco-Lab-Co, POBox 321, St. Louis, MO 63017, USA). 2.2.2.2. Phuong pháp hĩa sinh học (Immunochemical methods)
Phuong phap hĩa sinh miễn địch mang tính đặc hiệu cao, dựa trên nguyên lý kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu. Hai phương pháp hiện dùng là: Aflatoxin đánh dấu
phĩng xạ (radio-labeled Aflatoxin) va Aflatoxin gắn men (Pestka,1980, 1981). Do su tiến bộ của kỹ thuật miễn dịch trong những năm qua, đã phát triển nhiều hệ thống ELISA 7l
khác nhau để xác dinh Aflatoxin va khang thé don va da dong (monoclonal va polyclonal). Phuong phap sir dung
khang thé don dong (monoclonal) tổ ra đặc hiệu với
Aflatoxin B, và Aflatoxin B; (100-125%), với Aflatoxin G, tới 30%. Trong khi đĩ kháng thể đơn dịng (monoelonal) tỏ ra đặc hiệu với Aflatoxin B, và khơng phản ứng chéo với
Aflatoxin G, (Kawamura, 1988). Tuy nhiên Heile và Chư
(1990) cho ring khang thể đơn dịng cĩ phản ứng chéo với Aflatoxin B,, G,, G,.
Theo ý kiến của một số tác giả ở nhiều nước, việc xác định 4 loại Aflatoxin B,, B, và G, G, cĩ mặt trong tự nhiên mang tính thực tiễn hơn là chỉ xác định Aflatoxin B,. Do vậy dùng kháng thể đa dong hay don dong dé xác định Aflatoxin khơng trở nên nhất thiết.
* Phuong phap ELISA (enzyme - linked immunoabsorbant
assay)
Phuong phap ELISA gdm ELISA truc tiếp (direct) va ELISA gian tiép (indirect).
ELISA tryc tiép str dung Aflatoxin gin men (Aflatoxin - enzyme conjugate), ELISA gidn tép - Aflatoxin gan protein (Aflatoxin - protein conjugate) va mot khang thé thir hai (Secondary antibody) nhu IgG khang thé (anti rabit IgG). Cả hai phương pháp trực tiếp hay gián tiếp đều sử dụng men peroxidaza (HRP) và men photphataza kiềm để
gắn (Chu. 1984).