5. Những đóng góp mới của luận ân
1.5. Nghiín cứu đa dạng di truyền nguồn gen bí đỏ
1.5.2. Nghiín cứu đa dạng di truyền cđy bí đỏ bằng chỉ thị phđn tử ADN
ADN
Nghiín cứu đa dạng di truyền nguồn gen cđy bí đỏ đê được nhiều tâc giả trín thế giới tiến hănh nhằm mục đích cung cấp thơng tin cho câc nhă nghiín cứu để phât triển câc giống mới với câc tính trạng mong muốn năng suất, chất lượng, chống chịu [59], [65], [50], [75].
Nghiín cứu đa dạng dưới loăi bí đỏ C. moschata bằng chỉ thị ADN cũng được Trung Quốc rất quan tđm trong thời gian gần đđy. Theo Junxin Wu et
al., (2011) [57], nghiín cứu đặc điểm phđn tử, sử dụng chỉ thị AFLP được tiến hănh với câc mẫu nguồn gen của C. moschata thu thập ở Trung Quốc vă một số nguồn gen từ câc nước khâc cho thấy một mức độ đa hình cao. Câc mẫu nguồn gen từ Trung Quốc được phđn thănh hai cụm, phđn biệt rõ răng với câc mẫu nguồn gen có nguồn gốc từ Mexico, Guatemala, Honduras vă Ecuador. Nhóm giống Trung Quốc có liín quan về di truyền chặt chẽ với nhóm giống của câc nước chđu  khâc (Ấn Độ vă Nhật Bản). Nhìn chung, câc mẫu nguồn gen từ chđu Mỹ có một số lượng lớn câc locus độc đâo hơn so với câc mẫu nguồn gen ở Trung Quốc. Sự khâc biệt có thể lă do một số hạn chế về du nhập vă trôi dạt di truyền. Chđu Mỹ lă trung tđm nguồn gốc của C. moschata vă do đó đa dạng hơn. Với phđn tích chỉ thị AFLP, câc mẫu nguồn gen chia theo nhóm khơng có sự liín quan rõ răng theo hình dạng quả.
Một nghiín cứu khâc của Marilene Hilma et al., (2012) [71], với vật liệu lă giống địa phương Cucurbita thu thập từ câc trang trại nhỏ ở Brasil, sử dụng chỉ thị RAPD vă ISSR kết quả nghiín cứu cho thấy, hai chỉ thị phđn tử năy rất hiệu quả trong việc phđn nhóm giữa câc loăi (C. moschata, C. maxima, C.
pepo), nhưng đê không hiệu quả trong phđn tích sự đa dạng giống của từng
loăi cụ thể. Tuy nhiín, kết quả nghiín cứu cho thấy có sự đa dạng di truyền cao khi phđn tích chỉ thị hình thâi đối với câc tính trạng quả như kích cỡ, hình dạng vă mău sắc vỏ quả. Trín cơ sở đó đê kết luận, về cơ bản, có thể phđn biệt câc mẫu nguồn gen bản địa/địa phương một câch tốt hơn bằng câch sử dụng đặc điểm hình thâi học vă nơng học. Theo nghiín cứu sơ bộ đânh giâ về kỹ thuật gieo trồng (việc trộn lẫn hạt giống địa phương vă thương mại khi gieo hạt) vă trộn lẫn giữa câc giống địa phương cũng lă nguyín nhđn tạo ra sự đa dạng cao của nguồn gen C. moschata ở một số địa phương của Brasil.
Một thực tế khâc đâng được đề cập lă thơng thường tín gọi của giống địa phương được gọi rất khâc nhau điều năy gđy ra sự thiếu chính xâc khi xâc định câc mẫu nguồn gen. Tại bang Rio de Janeiro, hầu hết câc sản xuất nông nghiệp được thực hiện bởi người nông dđn, những người chịu trâch nhiệm cho hầu hết câc loại rau thương mại tại câc thị trường địa phương. Cạnh tranh về năng suất
vă chất lượng sản phẩm của họ tại thị trường dẫn đến việc sử dụng câc giống cải tiến với câc kiểu gen có sẵn, do đó loại bỏ câc nguồn gen bản địa, lăm ảnh hưởng việc bảo tồn nguồn tăi nguyín di truyền quan trọng. Thănh phần đa dạng di truyền được lưu giữ duy trì trong câc quần thể cđy trồng truyền thống được câc gia đình nơng dđn quản lý, lưu giữ trín đồng ruộng, lă kết quả của một quâ trình lựa chọn lđu dăi vă đa dạng, điều chỉnh phù hợp với thực tế địa phương. Do đó cho thấy, những nỗ lực của cộng đồng lă vơ cùng cần thiết để duy trì sự đa dạng di truyền năy. Điều năy không chỉ cần thiết ở Brasil mă còn cần thiết ở tất cả câc nước có trồng bí đỏ trong đó có Việt Nam.
Nghiín cứu đa dạng nguồn gen Cucurbita sử dụng chỉ thị ADN được nhiểu tâc giả sử dụng với sự đa dạng câc mẫu giống bí đỏ từ câc vùng địa lý khâc nhau như chỉ thị RAPD [45], [53], [112]; chỉ thị SSR [62],[63],[80], [90], [103].
Khi tiến hănh nghiín cứu 64 mẫu giống bí đỏ thuộc loăi C. pepo thu thập từ câc địa phương khâc nhau của Trung Quốc, nhóm tâc giả Wang et al.,
(2020) [109], sử dụng 45 tính trạng hình thâi vă 300 chỉ thị SSR thấy rằng mối tương quan giữa đa dạng về hình thâi vă phđn tử ở mức trung bình. Sự phđn tích đa dạng chi Cucurbita sử dụng câc chỉ thị ADN cũng đê được thực
hiện nhưng chưa nhiều. Trong chi Cucurbita, loăi C. pepo được nghiín cứu đa dạng nguồn gen mức độ phđn tử ADN nhiều nhất [36], [45], [60], [89]. Tiếp đó lă loăi C. moschata với việc thiết lập quan hệ di truyền giữa câc giống vă giữa câc loăi với nhau [30], [38], [79], [94], [108].
Nghiín cứu đânh giâ đa dạng di truyền của 20 nguồn gen bí đỏ C. moschata thu thập từ câc vùng khâc nhau của Ấn Độ thông qua việc đânh giâ câc tính trạng hình thâi vă ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiín (RAPD) Muralidhara & Narasegowda (2014)[78] thấy rằng: đê có tổng cộng 21 điểm được tạo ra từ 3 mồi RAPD, trong đó có 1 mồi lă đơn hình, 1 mồi lă đa hình. Một nhóm lă câc kiểu gen thănh 2 cụm A vă B ở khoảng câch liín kết 9. Cụm B lă nhóm chính bao gồm 12 nhóm, kiểu gen CM - 14
được chia thănh 6 nhóm phụ. Cụm A thứ hai bao gồm 8 phần được phđn tâch ở 3 khoảng câch liín kết vă được chia thănh 2 nhóm. Ma trận khâc biệt di truyền dựa văo khoảng câch di truyền dựa trín khoảng câch bình phương, thấy rằng sự khâc biệt tối đa (10%) giữa câc kiểu gen Bangalore local - 2 vă
Magadi local vă sự khâc biệt tối thiểu (1%) giữa CO - 2 vă Solan Badam, CO - 2 vă Banganlore - 1, KIC - 1 vă IIHR - 5.
Murovec et al., (2015) [85] đê tiến hănh đânh giâ 51 dịng bí được thu thập từ nhiều nguồn vă quốc gia khâc nhau, với đặc điểm vỏ hạt khâc nhau. Phđn tích di truyền sử dụng 18 chỉ thị phđn tử SSR cho thấy 37,59% tổng số đa dạng di truyền lă do sự khâc biệt giữa câc quần thể vă 62,41% do sự khâc biệt của câc câ thể trong quần thể. Sự khâc biệt di truyền trung bình giữa câc dòng từ 0,030 đến 0,760.
Những năm gần đđy, Nontuthuko et al., (2015) [85] sự đa dạng di truyền của 7 dòng C. pepo bằng sử dụng câc chỉ thị phđn tử (RAPD) vă chỉ thị (SSR) cho thấy trong 36 vă 55 mồi thử nghiệm, có 9 mồi RAPD vă 10 mồi SSR được chọn vì có khả năng tâi lập vă tính đa hình cao. Sử dụng RAPD đê phât hiện 100 băng, có đến (94%) băng được coi lă đa hình. Câc chỉ thị SSR cho tổng số 56 alen, trong đó 38 (68%) alen lă đa hình. Câc kích thước của câc băng dao động từ 75 đến 1800 bp vă từ 124 đến 251 bp tương ứng trong câc chỉ thị RAPD vă SSR. Sự khâc biệt về di truyền giữa câc quần thể dao động từ 0,0022 vă 0,0100 với chỉ thị RAPD vă từ 0 đến 0,0076 với chỉ thị SSR. Cả hai kỹ thuật đều phđn biệt câc dịng rất hiệu quả, nhưng chỉ có chỉ thị RAPD mới có thể phđn biệt câc dịng theo sự thay đổi mău sắc của quả khi trưởng thănh cũng như nguồn gốc nông sinh học của chúng.
Theo Moya-Hernândez et al., (2018) [76] phđn tích phđn nhóm khi sử
dụng chỉ thị AFLP cho thấy 89,4-99,4% sự giống nhau trong bộ gen của một số loăi Cucurbita được thu thập ở câc địa điểm khâc nhau. Kết quả nghiín cứu của Gong et al., 2012 [49] cho thấy, giâ trị khoảng câch di truyền trung bình giữa câc loăi Cucurbita dao động từ 0,37 đến 0,78.
Nhóm nghiín cứu Daniela et al., (2018) [34] đê tiến hănh đânh giâ mức độ đa dạng di truyền của 9 quần thể Cucurbita argyrosperma sử dụng 20 cặp mồi SSR. Kết quả tâm mươi bảy alen với 75% đến 100% locut đa hình đê được xâc định. Sự đa dạng di truyền căng lớn trong câc quần thể C. argyrosperma hoang dại có thể lă sản phẩm của sự tâi tổ hợp giữa những
quần thể năy được thúc đẩy bởi sự thụ phấn vă sự chọn lọc của con người. Njung’e et al., (2019) [84] đê tiến hănh đânh giâ đa dạng di truyền một
số loăi C. pepo sử dụng 39 chỉ thị phđn tử SSR. Kết quả cho 132 alen, trung bình 4,40 alen trín mỗi locut vă có thơng tin đa hình trung bình (PIC) vă đa dạng kiểu gen tương ứng lă 0,44 vă 0,49.
Chỉ thị phđn tử (molecular marker) hay chỉ thị ADN lă một loại chỉ thị di truyền, bao gồm những đặc tính sinh học được xâc định bằng dạng hình alen gen hoặc locut gen vă có thể được truyền từ thế hệ năy sang thế hệ khâc [8]. Chỉ thị ADN lă chỉ thị đại diện cho câc vị trí cụ thể trín nhiễm sắc thể, lă loại chỉ thị phổ biến nhất, không phụ thuộc văo câc giai đoạn phât triển của cđy vă không bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường [12].
Chỉ thị ADN gồm nhiều loại khâc nhau, như RAPD, RFLP, SSR, AFLP, v.v… đê được sử dụng để mơ tả nguồn gen họ bầu bí, nghiín cứu mối quan hệ phât sinh ở mức độ trín loăi, loăi vă dưới loăi. Chỉ thị plasmid cũng được dùng trong nghiín cứu ADN lục lạp, lăm cho chúng đặc biệt có giâ trị cho việc thể hiện mối quan hệ phât sinh ở mức độ loăi hoặc cao hơn mức độ loăi vă lăm sâng tỏ mối quan hệ giữa những nhóm Cucurbita đê được thuần hô [35], [113].
Ngăy nay, câc chỉ thị phđn tử được xem lă công cụ đânh giâ đa dạng di truyền hiệu quả. Câc chỉ thị phđn tử cung cấp một lượng thông tin, mơ tả câc mẫu giống nghiín cứu. Có nhiều kỹ thuật, loại chỉ thị phđn tử khâc nhau, một số chỉ thị đê được sử dụng để phđn tích đa dạng di truyền nguồn gen bí đỏ như RAPD, RFLP, AFLP, SSR, ISSR … vă phương phâp sử dụng dữ liệu trình tự ADN.
Theo Nguyễn Đức Thănh, (2014) [17] SSR có thể phđn biệt câc câ thể có mối quan hệ gần. Điểm hạn chế quan trọng của kỹ thuật chỉ thị SSR lă cần phải đọc trình tự genome để dựa văo đó có thể thiết kế câc cặp mồi đặc thù vă tối ưu hóa điều kiện câc mồi cho từng loăi trước khi sử dụng. Hiện nay, SSR lă chỉ thị được chọn cho câc nghiín cứu hồ sơ phâp lý, di truyền quần thể vă nghiín cứu động vật hoang dê. Ở thực vật SSR được sử dụng trong nghiín cứu đa dạng di truyền, trong chọn cặp lai, trong xâc định con lai vă trong lập bản đồ liín kết phđn tử.
Câc gen/tính trạng quan tđm, chọn giống bằng phương phâp nhờ chỉ thị phđn tử lă việc sử dụng chỉ thị di truyền để kiểm soât khu vực chứa bộ gen mê hóa cụ thể đặc điểm của cđy trồng. Hay nói câch khâc, sử dụng chỉ thị phđn tử liín kết chặt với locut gen đích để xâc định tính trạng mong muốn thay cho kiểm tra hay đânh giâ kiểu hình. Để việc chọn giống có hiệu quả, xâc định được chỉ thị phđn tử đa hình giữa bố mẹ vă câc câ thể trong quần thể phđn tích. Với chỉ thị phđn tử, cho phĩp câc nhă chọn giống, xâc định chính xâc câc gen/locus gen qui định những tính trạng mong muốn.
Câc nghiín cứu về gen qui định tính trạng của cđy bí đỏ lă rất đâng kể, mặc dù chưa có bản đồ hoăn chỉnh về genome của câc loăi của Chi Cucurbita. Năm 2005, Harry et al., [53] đê công bố một danh sâch gen của Cucurbita có
48 locut đa hình isozyme vă 79 locut qui định tính trạng kiểu hình/hình thâi được xâc định. Trong đó có đến 66 gen được xâc định cho loăi C. pepo; 21
gen của C. moschata; 19 gen của C. maxima; con lai giữa C. maxima × C. ecuadorensis có 29 gen đê được xâc định, có 25 gen lă biến thể isozyme, một
hoặc hai gen cũng đê được xâc định trong bốn loăi hoang dê (C.
okeechobeensis, C. lundelliana, C. foetidissima vă C. ecuadorensis) vă trong
phĩp lai khâc loăi khâc. Đặc biệt lă hai loăi trồng trọt khâc lă C. argyrosperma vă C. Ficifolia khơng có gen năo được xâc định. Tâc giả cũng
chỉ đưa ra một số gen điển hình qui định một số tính trạng có giâ trị cao trong cơng tâc chọn giống bí đỏ. Ví dụ như đặc điểm về thđn lâ, trong loăi C. pepo
vă C. maxima, alen Bu qui định lóng ngắn; cịn gen lặn de lă yếu tố quyết
Theo Gwanama et al., (2000) [52], chỉ thị phđn tử ADN đa hình được khuếch đại ngẫu nhiín (RAPD) cung cấp một phương phâp nhanh chóng vă đâng tin cậy để giải quyết câc mối quan hệ di truyền. Nhóm nghiín cứu đê tiến hănh phđn tích đa dạng di truyền câc giống C. moschata được trồng ở trung tđm Nam Phi vă phđn loại câc giống nhằm hỗ trợ việc lựa chọn câc kiểu gen bố mẹ để cải thiện câc đặc tính của quả. Phđn tích nhóm dựa trín 39 đoạn ADN đa hình vă 105 đơn hình được khuếch đại bởi 16 đoạn mồi RAPD đê sử dụng để chỉ ra mối quan hệ giữa 31 kiểu gen thu được từ Zambia & Malawi. Ứng dụng có tính khả thi của kết quả phđn loại trong chọn giống C. moschata đê được thảo luận trong nghiín cứu năy.
Năm 2020, Hă Minh Loan [10] đê phđn tích 100 mẫu giống bí đỏ với 41 chỉ thị SSR thấy rằng, có 23 chỉ thị cho câc alen đa hình, số lượng alen cao (từ 2 đến 8 alen/locut, biến động kích thước của câc alen khoảng 109bp đến 256bp. Đđy lă một trong số ít những kết quả nghiín cứu tiềm năng di truyền của cđy rau bản địa.
Nghiín cứu ứng dụng chỉ thị phđn tử phục vụ chọn tạo giống bí đỏ trín thế giới vă Việt Nam đê có nhiều, nhưng câc cơng trình nghiín cứu chủ yếu tập trung văo nghiín cứu ứng dụng chỉ thị phđn tử với một số tính trạng chất lượng khâc của bí đỏ, đi sđu về hăm lượng chất khơ của bí đỏ lă chưa nhiều, việc xâc định chỉ thị liín kết, lập bản đồ phđn tử liín kết với hăm lượng chất khơ bí đỏ lă chưa có. Vì vậy nghiín cứu năy lă cần thiết, giúp câc nhă chọn giống lựa chọn được nhiều giống bí chất lượng, phục vụ sản xuất bí đỏ ở Việt Nam.
Để chọn tạo giống lai (F1) cho năng suất cao, chất lượng tốt cần nắm được thông tin về mối quan hệ di truyền, bín cạnh câc kết quả đânh giâ sđu về đặc tính nơng sinh học của câc vật liệu nghiín cứu. Đoăn Xuđn Cảnh vă cs.,
(2019) [2] sử dụng 5 chỉ thị phđn tử RAPD vă 5 chỉ thị SSR để đânh giâ đa dạng di truyền của 26 mẫu giống bí xanh. Từ kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR vă SSR-PCR của câc chỉ thị, bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 đê phđn 26 mẫu giống bí xanh thănh 9 nhóm với hệ số tương đồng 0,7. Kết quả
nghiín cứu đê chỉ ra câc mẫu giống có độ sai khâc di truyền khâ cao, chúng có ý nghĩa quan trọng trong tạo giống bí xanh lai mới.
Năm 2011, nhóm tâc giả Ngơ Thị Hạnh [5] cũng đê sử dụng 20 chỉ thị RAPD để xâc định quan hệ di truyền giữa câc giống dưa chuột, câc dòng tự phối. Kết quả chỉ có 19 chỉ thị cho đa hình với tổng số 255 băng, khoảng câch di truyền giữa câc giống vă câc dòng tự phối tương ứng lă 0,2-0,56 vă 0-0,54.