Bảng 3.9 Câc tổ hợp lai bí đỏ tạo quần thể lai theo hướng
2.1. Sơ đồ câch tiếp cận nghiín cứu của luận ân
2.4.1. Phương phâp mô tả, đânh giâ đặc điểm nơng sinh học chính của câc mẫu giống bí đỏ câc mẫu giống bí đỏ
2.4.1.1. Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm đồng ruộng được bố trí theo phương phâp khối ngẫu nhiín đủ - RCBD (Randomized Complete Block Design) với 3 lần nhắc lại. Diện tích mỗi ơ thí nghiệm lă 15m2 (6m x 2,5m). Luống trồng rộng 2,5 m, rênh 0,3 m, cao luống 0,3 m.
- Kỹ thuật trồng vă chăm sóc tuđn theo quy trình canh tâc cđy bí đỏ do Trung tđm Tăi nguyín Thực vật ban hănh (2015) [22].
* Lăm cỏ, bón phđn vă vun xới
- Bón lót: Trước khi trồng, bón toăn bộ lượng phđn chuồng + toăn bộ lượng lđn supe + ¼ lượng đạm + ¼ lượng kali.
- Bón thúc lần 1: Sau khi trồng 20 - 25 ngăy, bón ¼ lượng đạm + ¼ lượng kali, bón thúc kết hợp lăm cỏ, xới xâo nhẹ vă vun nhẹ.
- Bón thúc lần 2: Sau khi trồng 40 - 50 ngăy, bón ¼ lượng đạm + ¼ lượng kali, kết hợp với lăm cỏ, xới sđu, vun gốc chuẩn bị cho giai đoạn ra hoa.
- Bón thúc lần 3: Bón thúc ni quả, bón khi cđy hình thănh quả non, bón toăn bộ lượng phđn cịn lại kết hợp với lăm cỏ.
* Tưới tiíu nước: Tưới đầy đủ cho thí nghiệm, đặc biệt trong giai đoạn gieo ươm cđy con vă giai đoạn sau trồng (giai đoạn đầu vụ: thâng 12, thâng 1), tưới nước theo rênh khi cđy đê lớn vă nhu cầu nước cao, nhất lă trong giai đoạn hình thănh quả, giữ cho mặt luống ẩm nhưng tân cđy phải khơ thơng. Tiíu nước kịp thời khi văo đầu mùa mưa cũng lă giai đoạn quả lớn vă chín.
* Thu hoạch: Tiến hănh thu hoạch quả khi trín cđy có khoảng 95% số quả ngả mău. Thu riíng từng ơ, để quả trong phịng cho hạt chín đẫy, bổ quả, tâch hạt, rửa sạch vă phơi khô hạt trong điều kiện trânh ânh nắng trực tiếp.
+ Gieo ươm cđy con trong khay, trồng cđy con khi đạt 2 - 3 lâ thật, trồng 2 hăng nanh sấu trín luống, cđy câch cđy 75 cm.
+ Lượng phđn bón cho 1 ha là: 25 tấn phđn chuồng, 250 kg urí, 450 kg supe lđn và 300 kg kali.
2.4.1.2. Câc chỉ tiíu theo dõi
- Phương phâp đânh giâ câc đặc điểm hình thâi, nơng sinh học: thực hiện theo biểu mô tả đânh giâ nguồn gen cđy bí đỏ do (Trung tđm Tăi nguyín thực vật biín soạn vă ban hănh năm 2015) [22]. Câc chỉ tiíu đânh giâ được thực hiện trín 10 cđy hoặc bộ phận của cđy, riíng câc chỉ tiíu về quả được quan sât trín 5 quả.
Thời gian sinh trưởng (ngăy):
- Tính số ngăy từ khi gieo đến thu quả chín cuối cùng. + Ngăy gieo hạt (ngăy)
+ Thời gian từ khi gieo hạt đến nảy mầm (ngăy) + Tổng thời gian sinh trưởng (ngăy)
- Giai đoạn quả, quả chín sinh lý
+ Hình dạng, chiều dăi quả, đường kính quả. + Mău sắc của thịt quả.
+ Độ dăy thịt quả.
- Câc tính trạng đo đếm:
+ Kích cỡ phiến lâ, đo chiều dăi lâ (cm) từ nút đầu lâ đến hết thùy dưới của phiến lâ; chiều rộng lâ (cm) đo chiều rộng nhất của lâ; chiều dăi cuống lâ (cm), đo từ cuống lâ tới điểm cuống lâ đính với phiến lâ; chiều dăi cuống lâ (cm), đo từ gốc cuống lâ tới điểm cuống lâ đính với phiến lâ; chiều dăi quả (cm), đường kính quả (cm) đo phần rộng nhất của quả, sau đó lấy tỷ lệ chiều dăi quả/đường kính quả; độ dăy thịt quả (mm) đo phần dăy nhất ở khoảng chứa hạt.
- Đânh giâ một số chỉ tiíu chất lượng bí đỏ
Đânh giâ chất lượng bí đỏ qua một số chỉ tiíu:
+ Mău sắc thịt quả: quan sât vă khoanh mê điểm theo câc trạng thâi tính trạng phù hợp.
+ Cường độ mău sắc của thịt quả: quan sât vă khoanh mê điểm theo câc trạng thâi tính trạng phù hợp.
- Yếu tố cấu thănh năng suất vă năng suất:
+ Số quả trung bình trín cđy: đếm tổng số quả trín 3 cđy vă lấy giâ trị
trung bình
+ Khối lượng quả chín trung bình/quả (kg): cđn khối lượng 5 quả, lấy giâ trị trung bình.
+ Khối lượng quả/ơ thí nghiệm (kg): cđn toăn bộ số quả thu được trín ơ + Năng suất lý thuyết (NSLT) (tấn/ha): (số cđy trín m2 x số quả trín cđy x khối lượng quả trung bình) x 10.000. Đơn vị tính: (Kg x 10-3)
+ Năng suất thực thu (tấn/ha) = năng suất của những cđy cho thu hoạch thực tế trín mỗi ơ thí nghiệm (cđn tổng số câc đợt thu/lô vă quy ra năng suất 1 ha).
2.4.2. Phương phâp phđn tích câc chỉ tiíu hóa sinh liín quan đến chất
lượng
Câc chỉ tiíu chất lượng được phđn tích trong phịng thí nghiệm vă trín mây phđn tích. Lựa chọn mẫu để phđn tích được tiến hănh ngẫu nhiín đối với quả chín sinh lý có hình dạng vă khối lượng trung bình của câc lần nhắc lại ở mỗi giống. Câc mẫu được trộn đều để phđn tích câc chỉ tiíu bằng mây phđn tích vă phương phâp phđn tích trong phịng thí nghiệm của Bộ mơn Kiểm nghiệm chất lượng rau quả - Viện Nghiín cứu Rau Quả.
Phương phâp xâc định câc chỉ tiíu hăm lượng chất khơ, độ brix của thịt quả, hăm lượng vitamin C, hăm lượng β-carotene được phđn tích trong phịng thí nghiệm, cụ thể như sau:
Hăm lượng chất khơ (%): xâc định theo Tiíu chuẩn Việt Nam (TCVN 10696:2015) [20]:
Về nguyín tắc: tiến hănh xâc định hao hụt khối lượng sau khi sấy bằng câch trộng kỹ mẫu với kieselguhr hoặc vật liệu tương tự, sấy sơ bộ hỗn hợp vă cuối cùng sấy 2 giờ trong tủ sấy chđn không nhiệt độ 70 oC ± 1oC vă âp suất khoảng 6,6 kPa (66 mbar).
Thuốc thử: chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phđn tích vă nước đạt loại 3 trong TCVN 4851:1989. Sử dụng câc thiết bị dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm vă câc thiết bị sấy như tủ sấy chđn khơng, có bộ kiểm sơt nhiệt độ tự động, nhiệt kế vă âp kế chđn không. Tủ sấy phải đảm bảo sao cho sự thay đổi nhiệt độ ở câc vị trí khâc nhau trong tủ khơng vượt q 2 oC. Tủ sấy có bộ thơng hơi, bộ kiểm soât nhiệt độ tự động vă nhiệt kế. Tủ năy cho phĩp lưu thông nhanh vă đủ để trao đổi với khơng khí bín ngoăi sao cho có thể bỏ nhanh độ ẩm ban đầu. Thiết bị lăm khơ khơng khí như một cột nhồi bằng hạt chống ẩm silicagel có thỉ thị mới được lăm khơ (hoặc vật liệu tương tự). Bơm chđn không để thâo vă duy trì âp suất khơng lớn hơn 6,6 kPa (66 mbar) trong tủ sấy. Đũa thủy tinh đủ dăi để chạm đến mĩp trín của đĩa. Cđn phđn tích có độ chính xâc ± 1mg. Khi chuẩn bị mẫu thử thơng thường không
cần xử lý trước vă phĩp phđn tích theo phương phâp năy nín dựa văo khối lượng, câc kết quả được biểu thị bằng phần trăm khối lượng. Trộn kỹ mẫu trước khi phđn tích. Ở giai đoạn sấy sơ bộ cđn khoảng 1,5g kieselguhr cho văo đĩa kim loại, tiếp đó đặt đĩa, mở nắp để bín cạnh, cho văo trong tủ sấy vă sấy khô ở nhiệt độ 75oC sau tăng nhiệt độ lín tối đa 120oC trong ít nhất 4 giờ; sử dụng cđn phđn tích cđn 3 lần lặp lại, thực hiện nhanh để trânh mọi thất thôt ẩm do bay hơi, sau đó tính giâ trị trung bình [20].
Tính hăm lượng chất khơ tổng số, bằng phần trăm, theo Công thức sau:
0 2 1 100 m m m Ts
Trong đó: Ts lă hăm lượng chất khơ tổng số, tính bằng phần trăm (%); m0 lă khối lượng ban đầu của mẫu, tính bằng gam (g); m1 lă khối lượng của đĩa chứa kieselguhr, nắp vă tro, tính bằng gam (g); m2 lă khối lượng của đĩa chứa kieselguhr vă nắp, tính bằng gam (g); Cần tính đến mọi hệ số pha loêng vă mối liín hệ với khối lượng hoặc thể tích. Nếu mẫu cơ đặc đê được pha loêng đến nồng độ đơn (nồng độ ban đầu) thì phải ghi lại tỷ trọng tương đối của mẫu có nồng độ đơn đó. Hăm lượng chất khô tổng số bằng phần trăm (khối lượng) đến hai chữ số thập phđn.
+ Tiíu chuẩn phđn loại hăm lượng chất khơ (%) theo Tiíu chuẩn ngănh 10TCN 645:2005 [20] về tiíu chuẩn rau quả - Yíu cầu kỹ thuật.
Hăm lượng chất khô (%) < 6: thấp TCVN 10696:2015 [20] Hăm lượng chất khô (%) ≥ 6: cao TCVN 10696:2015 [20] Hăm lượng chất khô (%) > 10: rất cao [20]
- Độ brix của thịt quả (%): xâc định bằng mây đo độ Brix Atago Model PAL-1: quả bí khơ được gọt tâch vỏ, lấy riíng phần thịt quả, ĩp lấy nước, sau đó nhỏ văo mắt mây đo Atago PAL-1; đo 3 lần lặp lại, sau đó tính giâ trị trung bình [18].
- Đânh giâ hăm lượng Vitamin C (mg/100g): xâc định bằng phương phâp chuẩn độ bằng 2,6 Diclorophenolindophenol theo Tiíu chuẩn Việt Nam
(TCVN 6427-2:1998) [18]; Trộn mẫu thử với dung dịch chiết axit oxalic 2% (m/m), sao cho thể tích dịch chiết, tính bằng mililit gấp từ 1 đến 5 lần khối lượng phần mẫu thử tính bằng gam. Lọc dung dịch, loại bỏ văi miliit dịch lọc ban đầu. Dung dịch thuốc nhuộm mầu Hòa tan 50mg muối natri của 2,6 diclorophenolindophenol trong 150ml nước nóng (50-600C) chứa 42mg natri hydro cacbonat trong bình định mức dung tích 200ml thím nước đến vạch vă lọc, cho đến khi có mău hồng bền ít nhất trong 5 giđy. Lặp lại q trình năy thím hai lần, vă ghi lại thể tích dung dịch thuốc nhuộm mầu đê sử dụng cho mỗi lần, chính xâc đến 0,1ml. Thực hiện ba lần của cùng một mẫu. Lấy kết quả trung bình cộng câc giâ trị thu được của ba lần xâc định. Hăm lượng axit ascorbic, biểu thị bằng miligam trín 100g sản phẩm theo cơng thức sau:
Trong đó: m0 lă khối lượng của phần mẫu thử trong phần dịch lấy để chuẩn độ, tính bằng gam; m1 lă khối lượng của axit ascorbic tương đương với 1,0 ml dung dịch thuốc nhuộm, tính bằng miligam; V0 lă thể tích của dung dịch thuốc nhuộm dùng chuẩn độ, tính bằng mililit; V1 lă thể tích của dung dịch thuốc nhuộm dùng trong mẫu trắng tính bằng mililit. Lấy kết quả trung bình cộng câc giâ trị thu được của ba lần xâc định.
Hăm lượng β-carotene (µg/g): xâc định theo Tiíu chuẩn Việt Nam (TCVN 8972-2:2011) [19]; Chiết β-caroten ra khỏi dung dịch mẫu đê xă phịng hóa bằng dung môi hoặc hỗn hợp dung mơi thích hợp. Lặp lại quy trình chiết từ 3 đến 4 lần dùng câc lượng từ 50 ml đến 150 ml. Rửa hỗn hợp câc dịch chiết bằng nước (thường từ 2 đến 4 lần, mỗi lần dùng từ 50 ml đến 150 ml) đến trung tính. Kiểm tra độ tuyến tính của hăm hiệu chuẩn, dùng tối thiểu ba mức pha loêng của dung dịch gốc β-caroten. Tiến hănh ít nhất hai lần xâc định độc lập. Tính nồng độ khối lượng của β-caroten tổng số, r, bằng mililit trín 100g mẫu (mg/100g), theo Cơng thức (2):
(2) Trong đó:
As lă diện tích pic hoặc chiều cao pic đối với câc đồng phđn β-caroten thu được bằng dung dịch mẫu thử, tính bằng câc đơn vị diện tích hoặc đơn vị chiều cao;
c lă độ tinh khiết đê được hiệu chỉnh của nồng độ β-caroten trong dung dịch chuẩn tính bằng microgam trín mililit (µg/ml);
Vs lă tổng thể tích của dung dịch mẫu thử tính bằng mililit (ml); Vst thể tích bơm của dung dịch chuẩn, tính bằng microlit (µl);
Ast lă diện tích pic hoặc chiều cao pic đối với β-caroten thu được bằng dung dịch mẫu thử, tính bằng câc đơn vị diện tích hoặc đơn vị chiều cao; M lă khối lượng mẫu, tính bằng gam (g);
ViS lă thể tích bơm của dung dịch mẫu thử, tính bằng microlit (µl); 1000 lă hệ số chuyển đổi (microgam sang miligam);
100 lă hệ số chuyển đổi về hăm lượng trín 100g.
2.4.3. Phương phâp xâc định mẫu giống bí đỏ triển vọng
- Sử dụng chỉ số chọn lọc để chọn dòng:
Chỉ số chọn lọc giúp cho nhă chọn giống chọn được một hoặc nhiều giống (dịng) đồng thời trín một số tính trạng mong muốn theo mục tiíu đặt ra. Chỉ số chọn lọc được tính theo cơng thức:
I = 2 1 ) ( i i k i i x M A
Dựa văo cơng thức năy cho thấy: I = 0, khi tính trạng chọn lọc xi = đúng mục tiíu chọn giống (Mi); tuy nhiín điều năy khó xảy ra. Như vậy, chỉ số chọn lọc căng tiến gần đến 0 thì giống (dịng được chọn lọc căng gần mục tiíu của người chọn giống.
Tiến hănh tuyển chọn câc giống bí đỏ địa phương triển vọng bằng chương trình chọn dịng (Selection Index) của Nguyễn Đình Hiền (1995) dựa
trín một số chỉ tiíu: năng suất thực thu, hăm lượng chất khô, độ brix, β- caroten vă vitamin C. Với mục tiíu chọn lọc lă giâ trị mong muốn của từng chỉ tiíu trín; số mẫu giống bí đỏ tham gia tuyển chọn gồm 132 mẫu. Căn cứ văo tiíu chí tổng hợp để chọn ra được 14 mẫu giống gần nhất so với mục tiíu đặt ra, dựa theo khoảng câch Euclide (khoảng câch năy khơng tính đến mối quan hệ giữa câc biến), sử dụng lăm vật liệu chọn tạo giống bí đỏ mới vă giới thiệu cho sản xuất.
2.4.4. Phương phâp đânh giâ đa dạng di truyền của câc mẫu giống bí
đỏ sử dụng chỉ thị phđn tử SSR
2.4.4.1. Phương phâp tâch chiết ADN tổng số
Tâch chiết ADN của các mđ̃u giống bí đỏ vă quần thể F2, F3 dựa theo phương phâp CTAB của Doyle et al., (1987) [39].
* Câc bước tiến hănh:
1. Cắt 70- 80mg lâ tươi, non nghiền trong ni-tơ lỏng thănh dạng bột mịn. 2. Chuyển bột nghiền văo ống eppendorf 2ml đê có sẵn
3. Thím 1ml dung dịch đệm chiết ủ 65oC trong 90 phút, cứ 15 phút lắc đều 1 lần.
4. Cho thím 500 µl Chloroform: Isoamyl alcohol 24:1 (v:v), lắc đều 5 phút ở nhiệt độ phòng vă ly tđm 12.000 vòng/phút trong 15 phút
5. Chuyển dịch phía trín sang ống eppendorf 2ml mới, thím 500 µl Isopropanol để tạo tủa ADN. Ly tđm 12000 vòng/phút để thu tủa.
6. Rửa kết tủa 500µl đệm rửa I. Sau đó ly tđm 12.000 vịng/phút trong 5 phút để kết tủa.
7. Tiếp tục rửa bằng 500µl đệm rửa II. Sau đó ly tđm 12.000 vịng/phút trong 5 phút để kết tủa.
8. Để khơ ADN sau đó hịa tan trong 500µl TE.
9. Khử RNA bằng câch thím 4µl RNAse/eppendorf trong tủ ấm 37oC trong 3 giờ.
trong môi trường đệm TBE 0,5X cùng với lamda chuđ̉n, vă nồng độ ADN của mỗi mẫu được định bằng mây đo quang phổ ở mức OD 260nm vă OD 280 nm. Tỷ lệ OD260/OD280 cho biết độ tinh sạch của mẫu ADN.
ADN (µg/µl) = (OD260 x 50µg/µl)/1000.
2.4.4.2. Phương phâp nhận dạng ADN bằng PCR ở tập đoăn mẫu giống
- Phản ứng PCR được tiến hănh trín mây Veriti 96 well Thermal cycler. Tổng dung dịch phản ứng lă 20 µl bao gồm: 2µl PCR buffer 10x; 1,6µl dNTP 2,5mM; 1,4µl primer 25ng/ µl; 0,1µl green Taq (5U/µl); 5µl ADN (5ng/µl); 9,9 µl H20.
Điều kiện phản ứng: - 95oC trong 5 phút;
- Lă ̣p la ̣i 35 chu kỳ các bước dưới đđy: + 94 oC trong 1 phút;
+ Ta trong 1 phút (Ta lă nhiệt độ gắn mồi SSR, nhií ̣t đơ ̣ cu ̣ thí̉ tùy th ̣c vào mờ i SSR được sử dụng);
+ 72 oC trong 1 phút. - 72 oC trong 10 phút
- Bảo quản sản phđ̉m PCR ở 4 oC.
Điện di vă phât hiện sản phẩm PCR trín gel polyacrylamide 8% vă mây soi UV Transilluminator.
2.4.4.3. Phương phâp phđn tích số liệu kiểu gen
Câc băng ADN (alen) được phât hiện sau điện di sẽ được sử dụng để phđn tích, xâc định đa dạng di truyền của câc mẫu giống nghiín cứu. Trín gel/ảnh điện di; ở vị trí có băng ADN được mê bằng số 1, khơng có băng được mê lă 0, băng không rõ răng được mê lă - (dấu gạch); kết quả sẽ nhận được bảng dữ liệu số hóa chứa câc số 0 &1 của câc mẫu giống. Bảng dữ liệu năy sẽ được sử dụng để phđn tích đa dạng di truyền giữa câc mẫu giống thơng qua câc chỉ tiíu như: hệ số đa dạng di truyền.
Số liệu phđn tích SSR được nhập văo Excel vă xử lý bằng chương trình NTSYS-pc v. 2.1 để xđy dựng ma trận tương đồng di truyền. Tiếp theo, vẽ sơ