5. Những đóng góp mới của luận ân
2.4. Phương phâp nghiín cứu
2.4.4. Phương phâp đânh giâ đa dạng di truyền của câc mẫu giống bí đỏ sử
đỏ sử dụng chỉ thị phđn tử SSR
2.4.4.1. Phương phâp tâch chiết ADN tổng số
Tâch chiết ADN của các mđ̃u giống bí đỏ vă quần thể F2, F3 dựa theo phương phâp CTAB của Doyle et al., (1987) [39].
* Câc bước tiến hănh:
1. Cắt 70- 80mg lâ tươi, non nghiền trong ni-tơ lỏng thănh dạng bột mịn. 2. Chuyển bột nghiền văo ống eppendorf 2ml đê có sẵn
3. Thím 1ml dung dịch đệm chiết ủ 65oC trong 90 phút, cứ 15 phút lắc đều 1 lần.
4. Cho thím 500 µl Chloroform: Isoamyl alcohol 24:1 (v:v), lắc đều 5 phút ở nhiệt độ phòng vă ly tđm 12.000 vòng/phút trong 15 phút
5. Chuyển dịch phía trín sang ống eppendorf 2ml mới, thím 500 µl Isopropanol để tạo tủa ADN. Ly tđm 12000 vòng/phút để thu tủa.
6. Rửa kết tủa 500µl đệm rửa I. Sau đó ly tđm 12.000 vịng/phút trong 5 phút để kết tủa.
7. Tiếp tục rửa bằng 500µl đệm rửa II. Sau đó ly tđm 12.000 vịng/phút trong 5 phút để kết tủa.
8. Để khơ ADN sau đó hịa tan trong 500µl TE.
9. Khử RNA bằng câch thím 4µl RNAse/eppendorf trong tủ ấm 37oC trong 3 giờ.
trong môi trường đệm TBE 0,5X cùng với lamda chuđ̉n, vă nồng độ ADN của mỗi mẫu được định bằng mây đo quang phổ ở mức OD 260nm vă OD 280 nm. Tỷ lệ OD260/OD280 cho biết độ tinh sạch của mẫu ADN.
ADN (µg/µl) = (OD260 x 50µg/µl)/1000.
2.4.4.2. Phương phâp nhận dạng ADN bằng PCR ở tập đoăn mẫu giống
- Phản ứng PCR được tiến hănh trín mây Veriti 96 well Thermal cycler. Tổng dung dịch phản ứng lă 20 µl bao gồm: 2µl PCR buffer 10x; 1,6µl dNTP 2,5mM; 1,4µl primer 25ng/ µl; 0,1µl green Taq (5U/µl); 5µl ADN (5ng/µl); 9,9 µl H20.
Điều kiện phản ứng: - 95oC trong 5 phút;
- Lă ̣p la ̣i 35 chu kỳ các bước dưới đđy: + 94 oC trong 1 phút;
+ Ta trong 1 phút (Ta lă nhiệt độ gắn mồi SSR, nhií ̣t đơ ̣ cu ̣ thí̉ tùy th ̣c vào mờ i SSR được sử dụng);
+ 72 oC trong 1 phút. - 72 oC trong 10 phút
- Bảo quản sản phđ̉m PCR ở 4 oC.
Điện di vă phât hiện sản phẩm PCR trín gel polyacrylamide 8% vă mây soi UV Transilluminator.
2.4.4.3. Phương phâp phđn tích số liệu kiểu gen
Câc băng ADN (alen) được phât hiện sau điện di sẽ được sử dụng để phđn tích, xâc định đa dạng di truyền của câc mẫu giống nghiín cứu. Trín gel/ảnh điện di; ở vị trí có băng ADN được mê bằng số 1, khơng có băng được mê lă 0, băng không rõ răng được mê lă - (dấu gạch); kết quả sẽ nhận được bảng dữ liệu số hóa chứa câc số 0 &1 của câc mẫu giống. Bảng dữ liệu năy sẽ được sử dụng để phđn tích đa dạng di truyền giữa câc mẫu giống thơng qua câc chỉ tiíu như: hệ số đa dạng di truyền.
Số liệu phđn tích SSR được nhập văo Excel vă xử lý bằng chương trình NTSYS-pc v. 2.1 để xđy dựng ma trận tương đồng di truyền. Tiếp theo, vẽ sơ
đồ hình cđy biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa câc giống bí đỏ nghiín cứu được xđy dựng bằng phương phâp phđn nhóm UPGMA (Unweighted Pair- Group Method with Arithmetical averages) [68].
Hệ số tương đồng và khoảng cách di truyền tính theo công thức của Nei (1972) [82], Rohlf, F. J., 2000 [98]: I = 2 1 12 Q Q q (Hệ số tương đồng di truyền)
D = - ln (I) (Khoảng câch di truyền) *q 12: số câc alen đồng nhất ở cả 2 mẫu
*Q1 vă Q2: tổng số câc alen của nguồn gen 1 vă 2
Hệ số đa dạng di truyền hay hệ số thơng tin đa hình (PIC) được tính theo cơng thức Mohammadi (2003) [74] như sau: PIC = 1 - ∑hk2 (hk: tần số xuất hiện của alen thứ k).
Từ kết quả phđn tích vă tính tơn được để đưa ra kết luận bổ sung cho những đânh giâ về đa dạng di truyền trong bộ giống nghiín cứu.