) Ι ph1,ng pháp ∗o kh0 nΘng b6t giΧ gΑc tΕ do peroxyl ORACROO• (Kurihara et al.,
c.Ph!∃ng pháp xác :≅nh kh7 nΙng b0t gi< kim lo(
Kh0 nΘng b6t giΧ kim lo;i c.a các hΒp ch:t ∗1Βc xác ∗4nh b&ng ph1,ng pháp liên k∆t c;nh tranh (Agirova, Ortherth, 2003). MΟi 100 µl Ι các nΛng ∗Κ khác nhau c.a các hΒp ch:t pha trong n1+c ∗1Βc phΑi trΚn v+i 100 µl CuSO4 0.1 µM. Sau ∗ó, mΟi 100 µl hΟn hΒp ∗1Βc b sung vào 100 µl calcein 0,1 µM, huθnh quang c.a dung d4ch hΟn hΒp ∗1Βc ∗o b&ng thi∆t b4 ∗Ρc phi∆n 96 gi∆ng Tecan GENis v+i bΚ lΡc huθnh quang sΓ dΗng các b1+c sóng kích thích và phát quang t1,ng ≅ng là 485 và 535 nm và so sánh v+i c1Φng ∗Κ huθnh quang c.a mΤu ∗Αi ch≅ng chΜ ch≅a calcein.
Các b!#c ti%n hành:
+ Cho vào mΟi gi∆ng 100 µL dung d4ch calcein 100 µM.
+ B sung 100 µL hΟn hΒp (200 µL mΤu thΓ + 200µL CuSO4 0,4 uM) + >o huθnh quang b&ng thi∆t b4 Tecan GENis v+i bΚ lΡc huθnh quang sΓ dΗng các b1+c sóng kích thích và phát quang t1,ng ≅ng là 485 và 535 nm.
2.2.5. Ph∋2ng pháp Λánh giá ho)t tính &c ch enzym Σ-glucosidase
Ho;t tính ≅c ch∆ Υ-glucosidase ∗1Βc thΕc hi∃n dΕa vào ph0n ≅ng th.y phân 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside thành ∗1Φng glucose và p-nitrophenol, hΒp ch:t có màu vàng, d1+i xúc tác c.a enzyme Υ-glucosidase. Khi mΤu thΓ có ho;t tính ≅c ch∆ enzyme Υ-glucosidase, sΕ t;o thành hΒp ch:t p-nitrophenol sβ gi0m, do v)y m)t ∗Κ quang (OD) c.a p-nitrophenol so v+i mΤu ch≅ng ch∆ sβ gi0m theo. OD c.a p-
nitrophenol sinh ra sau ph0n ≅ng ∗1Βc ∗o Ι b1+c sóng 405nm và ∗1Βc dùng ∗< ∗ánh giá ho;t ∗Κng ≅c ch∆ enzyme c.a mΤu thΓ. Ho;t tính ≅c ch∆ enzym Υ- glucosidase ∗1Βc ti∆n hành theo ph1,ng pháp c.a Li và cΚng sΕ (Li et al., 2009).
T:t c0 các hóa ch:t sΓ dΗng ∗1Βc mua c.a hãng Sigma (St. Louis, MO, USA).
Tóm t0t các b!#c ti%n hành:
+ MΚt hΟn hΒp c.a 50 µl các ch:t và 50 µl ∗∃m phosphate 0,1 M (pH 7,0) có ch≅a dung d4ch enzym Υ-glucosidase (0,3 U/mL) và 50 l n1+c c:t ∗1Βc . trong các phi∆n 96 gi∆ng Ι nhi∃t ∗Κ 37 °C trong 15 phút.
+ Sau quá trình . khΙi ∗ϑu, 100 L c.a dung d4ch p-NPG 3 mM trong ∗∃m
phosphate 0.1 M (pH 7.0) ∗1Βc b sung vào mΟi gi∆ng t;i các các kho0ng thΦi gian giãn cách ∗4nh s_n.
+ HΟn hΒp ph0n ≅ng ∗1Βc . Ι 37 °C trong 10 phút và d2ng ph0n ≅ng b&ng các b sung 750 L Na2CO3 0,1 M.
+ C1Φng ∗Κ h:p phΗ ∗1Βc ∗o Ι b1+c sóng 405 nm b&ng thi∆t b4 FLUOstar Optima (BMG Labtech, Offenburg, Germany).
K∆t qu0 ∗1Βc bi<u th4 là % ≅ng ch∆ enzym Υ-glucosidase và ∗1Βc tính tốn theo cơng th≅c sau:
% ≅c ch∆ = x100 A A A control extract control =
Phân tích th∗ng kê. T:t c0 các thí nghi∃m ∗1Βc ti∆n hành l=p l;i 3 lϑn ∗< l:y
giá tr4 trung bình. SΑ li∃u ∗1Βc bi<u th4 d1+i d;ng: giá tr4 trung bình ± SD. Các k∆t qu0 ∗1Βc phân tích thΑng kê b&ng ch1,ng trình ANOVA và Duncan’s multiple range. Sai sΑ p < 0,05 ∗1Βc coi là có ý nghλa thΑng kê.