Sử dụng chương trình BLASTN ựể phát hiện những trình tự tương ựồng với các trình tự nghiên cứu ựã ựược công bố trong ngân hàng gen, nhằm xác nhận trình tự ựắch và chọn một số trình tự có ựộ tương ựồng cao ựể so sánh và phân tắch. Sử dụng chương trình phần mềm máy tắnh MEGA2 ựể ựối chiếu [123]. Phân tắch và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp tối thiểu (Maximum Parsimony (MP) method) và phương pháp tiến hoá tối thiểu (Minimum Evolution (ME) method) trên cơ sở khoảng cách di truyền theo mô hình Kimurạ Giá trị bootstrap của cây phát sinh chủng loại ME và MP ựược tắnh với 1000 lần lấy mẫu thử (resampling), dựa vào cây phả hệ người ta xác ựịnh ựược mối quan hệ của các chủng vi khuẩn cần kiểm trạ
2.3.5 Lựa chọn bổ sung các chất phụ gia vào chất mang ựể sản xuất chế phẩm vi sinh ựối kháng sinh ựối kháng
- Từ nguồn chất mang thường ựược sử dụng ựể sản xuất chế phẩm vi sinh là than bùn, ựề tài tiến hành nghiên cứu bổ sung các chất phụ gia: rỉ ựường, bột tôm cua, dịch chiết lá tắa tô,... vào chất mang. đánh giá khả năng tồn tại (mật ựộ tế bào VSV và hoạt tắnh sinh học) của các chủng VKđK ựể chọn chất mang thắch hợp nhất cho sản xuất chế phẩm.
- Thắ nghiệm ựược chia thành 6 công thức: gồm 2 nhóm, mỗi công thức lặp lại 3 lần.
Nhóm chất mang dạng bột
+ CT1.1: Than bùn
+ CT1.2: Than bùn + 1 % bột tôm cua
+ CT1.3: Than bùn + 5 % rỉ ựường + 1 % bột tôm cua + CT1.4: Than bùn + 5 % rỉ ựường
Nhóm chất mang dạng dịch
+ CT1.5: 5 % rỉ ựường
+ CT1.6: Dịch tắa tô + 2 % ựường glucose
- Các loại chất mang ựược ựóng gói theo công thức. Khử trùng 3 lần trước khi nhiễm dịch VSV (3 lần liên tiếp, cách nhau 24 giờ, 1210C trong 30 phút; ựối với
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 32
chất mang có ựường khử trùng ở 1080C trong 30 phút ựể các VSV tạp nhiễm trong chất mang bị tiêu diệt hoàn toàn).
- Chế phẩm dạng bột ựóng gói 50 g/túi nylon chịu nhiệt có ựộ dầy 0,5 mm, chế phẩm dịch 100 ml/ bình.
- Các chủng VKđK (VKB2, VKPS, VKM2) ựược nuôi cấy 48 giờ trên môi trường ựặc hiệu cho từng chủng, sau ựó ựược nhiễm vào chất mang với tỷ lệ 1 phần dịch nuôi cấy VKđK với 4 phần chất mang. đối với các công thức nhiễm hỗn hợp chủng vi khuẩn ựối kháng tỷ lệ dịch nuôi cấy mỗi chủng bằng 1/3 lượng dịch nuôi cấy của hỗn hợp, tuy nhiên tổng lượng dịch là bằng với nhiễm ựơn chủng.
- Sau khi nhiễm, các túi nilon ựược hàn kắn miệng túi hoặc nút, bao kắn ựối với bình chứa chất mang dạng dịch ựể tránh tạp nhiễm bên ngoài vàọ
- Chế phẩm ựược bảo quản ở nhiệt ựộ phòng, ựể ở nơi sạch sẽ, thoáng mát, tránh ánh nắng mặt trời rọi trực tiếp.
- định kỳ sau 15, 30 ngày ựánh giá khả năng tồn tại của VSV theo phương pháp xác ựịnh mật ựộ tế bào và hoạt tắnh ựối kháng nấm gây bệnh ựốm nâu của các chủng vi khuẩn theo phương pháp ựục lỗ thạch.
2.3.6 đánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm từ các chủng vi khuẩn ựối kháng trong phòng chống bệnh nấm hại chè trong phòng chống bệnh nấm hại chè
Thắ nghiệm 1: đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh (dạng dịch) ựến khả năng phòng trừ nấm bệnh trên cây chè kinh doanh tại Nậm Búng, Suối Giàng, Yên Báị
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 33
Thắ nghiệm ựược bố trắ với quy mô 500 m2, 5 công thức 3 lần nhắc lại gồm: CT2.1: đối chứng, không phun chế phẩm
CT2.2: Phun chế phẩm, liều lượng 40 lắt/ha CT2.3: Phun chế phẩm, liều lượng 50 lắt /ha CT2.4: Phun chế phẩm, liều lượng 60 lắt /ha CT2.5: Phun chế phẩm, liều lượng 70 lắt /ha Sơ ựồ bố trắ thắ nghiệm như sau:
Hàng cây CT2.1 CT2.1 CT2.2 CT2.3 CT2.4 CT2.5 CT2.1 CT2.1 CT2.1 CT2.2 CT2.3 CT2.4 CT2.5 CT2.1 CT2.1 CT2.1 CT2.2 CT2.3 CT2.4 đường ựi CT2.5 Lều Bảo vệ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 34
Thắ nghiệm 2: đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh (dạng bột) ựến khả năng phòng trừ nấm bệnh trên cây chè kinh doanh tại Bản Công, Trạm Tấu, Yên Bái
Hình 2.2. Sơựồ bố trắ thắ nghiệm trên cây chè tại Bản Công
Thắ nghiệm ựược bố trắ với quy mô 500 m2, 5 công thức 3 lần nhắc lại gồm: CT3.1: đối chứng, không bón chế phẩm
CT3.2: Bón chế phẩm, liều lượng 40 kg/ha CT3.3: Bón chế phẩm, liều lượng 50 kg/ha CT3.4: Bón chế phẩm, liều lượng 60 kg/ha CT3.5: Bón chế phẩm, liều lượng 70 kg/ha Sơ ựồ bố trắ thắ nghiệm như sau:
đỉnh ựồi Bảo vệ 3.1 3.1 3.1 3.2 3.2 3.2 3.3 3.3 3.3 3.4 3.4 3.4 3.5 3.5 3.5 Bảo vệ Rãnh nước
Các công thức xử lý nhiễm chế phẩm vi sinh vật ựược nhiễm vào ựất hoặc phun lá ựảm bảo mật ựộ tế bào VSV ựạt 106 CFU/ g ựất hoặc 106 CFU/ m2 lá.
Các chỉ tiêu theo dõi trong thời gian 1- 2 tháng sau khi phun/bón chế phẩm:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 35
+ Sinh trưởng và phát triển của cây chè (chiều cao cây, ựường kắnh tán) ựược tiến hành theo phương pháp ựo ựếm trực tiếp.
+ Khả năng hạn chế nấm gây bệnh hại chè (tỷ lệ, chỉ số và mức ựộ nấm bệnh hại chè) ựược tiến hành theo phương pháp của Viện BVTV (Phương pháp nghiên cứu BVTV, tập 1. 1997, Quyết ựịnh BNN).
Mức ựộ bệnh hại trên lá ựược ựánh giá theo thang sau: Cấp 1: < 1% diện tắch lá bị hạị Cấp 3: 1 ựến 5% diện tắch lá bị hạị Cấp 5: > 5 ựến 25% diện tắch lá bị hạị Cấp 7: > 25 ựến 50% diện tắch lá bị hạị Cấp 9: > 50% diện tắch lá bị hạị Tắnh tỷ lệ bệnh theo công thức: TLB %= số lá bị bệnh/tổng số lá ựiều tra x 100 Chỉ số bệnh tắnh theo công thức: CSB = tổng (N1 + N3 + ...+ Nn)/N.n x 100 N1, N3...Nn: Số lá bị bệnh ở mỗi cấp 1,3...n N: Tổng số lá ựiều tra n: Cấp bệnh cao nhất 2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu ựược xử lý thống kê toán học theo IRRISAT 5.0 và chương trình EXCEL 2003
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 36
Chương 3