2.1.1. Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện: từ Tháng 6/2012 ñến tháng 8/2013
2.1.2. ðịa ñiểm nghiên cứu
- Phòng thí nghiệm và khu nhà lưới thuộc Bộ môn Vi sinh - Viện Nông hóa Thổ nhưỡng.
- Xã Nậm Búng, huyện Văn Chấn và Bản Công, Trạm Tấu, tỉnh Yên Bái
2.2. Vật liệu nghiên cứu
- Nấm Colletotrichum camelliae Masse gây bệnh ñốm nâu hại chè và các chủng vi sinh vật có khả năng ñối kháng nấm gây bệnh hại chè VKB5, VKPS, VKM2 ñược phân lập từ các mẫu ñất trồng chè của huyện Văn Chấn, Trấn Yên, Yên Bình của tỉnh Yên Báị
- Cây chè Shan tuổi 8 tại xã Nậm Búng, huyện Văn Chấn và cây chè Shan tuổi 10 tại xã Bản Công, Trạm Tấu, tỉnh Yên Bái
- Các thiết bị, hóa chất thuộc Bộ môn Vi sinh vật - Viện Thổ nhưỡng Nông hóạ
- Các môi trường dùng ñể nuôi cấy, nhân sinh khối các chủng vi khuẩn ñối kháng
+ Môi trường PDA (Potato dextro agar): ðể phân lập và thử hoạt tính ñối kháng của nấm bệnh: Khoai tây 200g; glucoza 20g; thạch 12g; nước cất 1000ml.
+ Môi trường King B (KB): Yeast extract 5g; pepton 20g; glyxerin 5 ml; K2HPO4 (12,5%) 12 ml; MgS04.7H20 (6,25%) 25ml; nước cất 1000ml.
+ Môi trường Pikovskaya: ðể thu sinh khối vi khuẩn ñối kháng: Glucoza 10g; Ca3(PO4)2 5g; ( NH4)2SO4 0.5g; NaCl 0.2g; MgSO4.7H20 0.1g; KCl 0.2g; Cao nấm men 0.5g; MnSO4 vết; FeSO4.7H20 vết; Thạch 12g; Nước cất 1000ml
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 27
3.0g; MgSO4.7H2O 0.5g; KCl 0.5g; FeSO4 . 7H2O 0.01g; K2HPO4 1.0g; Thạch 12g; Nước cất 1000 ml.
+ Môi trường SPA (Sucrose peptone agar): ðể thử hoạt tính của các chủng vi sinh vật ñối kháng: Saccarosa 20g; Pepton 5g; K2HPO4 0.5g; MgSO4.7H2O 0.25g; Thạch 12g, Nước cất 1000ml.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xác ñịnh mật ñộ vi sinh vật (theo phương pháp Koch)
Mật ñộ vi sinh vật ñược xác ñịnh dựa trên phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch ñĩa, tính số lượng vi sinh vật trên mililit hoặc trên gam mẫu thông qua số khuẩn lạc phát triển trong các ñĩa môi trường.
Cân 10 g mẫu cho vào bình tam giác 250 ml có chứa 90 ml nước muối sinh lý vô trùng. Sau ñó ñem lắc trên máy lắc có tốc ñộ 150 vòng/phút trong 30 phút, thu ñược dịch pha loãng có nồng ñộ là 10-1. Sau ñó hút 1 ml dịch trong bình pha loãng nồng ñộ 10-1 sang ống nước muối sinh lý 9 ml ñã khử trùng, ñược nồng ñộ pha loãng 10-2. Tiếptục pha loãng như trên ñược nồng ñộ pha loãng 10-3, 10-4..., ñến nồng ñộ pha loãng cần thiết. Hút 0,05ml dịch ñã pha loãng nhỏ vào các hộp peptri chứa môi trường thạch ñặc hiệụ Dùng que trang thủy tinh ñã vô trùng trang ñều lên mặt môi trường trong hộp peptrị Sau khi trang xong dùng giấy gói lại và chuyển các hộp peptri chứa VSV vào tủ ấm và nuôi ở nhiệt ñộ thích hợp.
Sau khoảng 2 – 4 ngày nuôi cấy, lấy mẫu ra quan sát và ñếm số khuẩn lạc mọc trên các hộp peptrị
Công thức tính mật ñộ tế bào VSV: N = An x 20 x 10n
Trong ñó: N là mật ñộ vi sinh vật trên một ñơn vị kiểm tră CFU/g hoặc CFU/ ml) A là mật ñộ vi sinh vật ñếm ñược ở mỗi nồng ñộ pha loãng
n là nồng ñộ pha loãng Ghi chú:
- Công thức chỉñúng với lượng dich vi khuẩn nhỏ trên bề mặt môi trường là 0,05 ml
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 28
- Biểu thị mật ñộ vi sinh vật/1 ñơn vị kiểm tra bằng cách lấy 1 trong các giá trị từ 1,00 ñến 9,00 nhân với 10x trong ñó x là số mũ của 10
2.3.2. Phương pháp xác ñịnh hoạt tính ñối kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn ñối kháng theo 10TCN 867- 2006 khuẩn ñối kháng theo 10TCN 867- 2006
Có 2 phương pháp
* Phương pháp ñục lỗ thạch
- Dùng pipet vô trùng hút 0,05 ml huyền phù nấm Colletotrichum camelliae masse ñã pha loãng vào ñĩa peptri chứa môi trường PDA - agar ñã chuẩn bị sẵn. Dùng que gạt vô trùng trải ñều nấm bệnh lên bề mặt môi trường ñến khi bề mặt môi trường khô.
- Dùng ống kim loại vô trùng khoan lỗ thạch ở tâm ñĩa peptri ñã trải ñều nấm bệnh, loại bỏ phần thạch vừa khoan. Chú ý tránh làm vỡ thạch hoặc chạm vào bề mặt thạch xung quanh lỗ ñục.
- Dùng pipet vô trùng hút 1 giọt dịch VKðK ñưa vào lỗ thạch ñã chuẩn bị ở trên. Chú ý nhỏ sao cho dịch vi khuẩn không tràn lên miệng lỗ thạch. ðể yên 1 -2h cho các hoạt chất khuếch tán vào môi trường, gói cẩn thận giữ ở nhiệt ñộ 30 – 37 0 C, thời gian từ 48 – 72 h tùy thuộc vào loài VSV cần xác ñịnh hoạt tính.
- Quan sát vòng ức chế hằng ngày ñến khi nấm gây bệnh phát triển trên toàn bộ bề mặt môi trường.
- ðọc kết quả: Hoạt tính ñối kháng ñược xác ñịnh bằng kích thước vòng ức chế, là vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch nơi mà vi sinh vật gây bệnh không sinh trưởng ñược.
- Hoạt tính ñối kháng nấm của các chủng vi khuẩn (mm) = D - d Trong ñó D: ðường kính vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch (mm)
d: ñường kính lỗ khoan (mm) * Phương pháp chấm ñiểm
- Dùng pipet vô trùng hút 0,05 ml huyền phù vi sinh vật gây bệnh ñã pha loãng vào ñĩa pettri chứa môi trường ñặc hiệu (môi trường ñặc) ñã chuẩn bị sẵn. Dùng que gạt vô trùng trải ñều nấm bệnh lên bề mặt môi trường ñến khi bề mặt môi trường khô.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 29
- Cấy trực tiếp sinh khối của VKðK cần kiểm tra lên bề mặt môi trường ñã phủ VSV gây bệnh. Gói cẩn thận nuôi trong tủ ấm ở nhiệt ñộ 30 0C, thời gian từ 48 - 72 h tùy thuộc vào loài VSV cần xác ñịnh hoạt tính.
- Quan sát vòng ức chế, dựa vào kích thước vòng ức chế ñể ñánh giá hiệu lực ñối kháng của chúng.
2.3.3. Xác ñịnh một sốñặc ñiểm sinh học và ảnh hưởng của một sốñiều kiện môi trường (pH, nhiệt ñộ, oxy, môi trường dinh dưỡng) ñến sinh trưởng, phát triển và trường (pH, nhiệt ñộ, oxy, môi trường dinh dưỡng) ñến sinh trưởng, phát triển và khả năng phòng chống bệnh nấm hại chè của các chủng vi khuẩn ñối kháng
ạ ðặc ñiểm sinh học
ðể các chủng vi khuẩn biểu hiện ñầy ñủ các ñặc ñiểm sinh học người ta thường xuyên nuôi cấy chúng trên các môi trường dinh dưỡng ñặc hiệu cho từng chủng trong ñiều kiện nhiệt ñộ và thời gian nhất ñịnh. Tiến hành quan sát, mô tả, chụp ảnh và ghi lại các ñặc ñiểm của chúng
3 chủng vi khuẩn ñược nuôi trên các môi trường ñặc hiệu: - VKB5 trên môi trường King B
- VKPS trên môi trường SPA - VKM2 trên môi trường King B
Phương pháp: Dùng que cấy vô trùng lấy một ít sinh khối của chủng VSV trong ống giống cho vào eppendort có chứa 0,9ml nước cất ñã khử trùng, ñem lắc trên máy vontex khoảng 1 phút cho sinh khối của VSV ñược pha loãng, thu ñược dịch pha loãng có nồng ñộ là 10-1. Hút 0,1ml dịch trong eppendort pha loãng nồng ñộ 10-1 sang ống eppendort chứa 0,9ml nước cất ñã khử trùng ñược nồng ñộ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng như trên ñược nồng ñộ pha loãng 10-3, hút 0,05ml dịch pha loãng ở nồng ñộ 10-3 nhỏ vào các hộp pettri chứa môi trường thạch ñặc hiệụ Dùng que trang thủy tinh ñã vô trùng trang ñều lên mặt môi trường trong hộp pettri thứ nhất, không ñốt que trang, tiếp tục trang ñều lên mặt môi trường trong hộp pettri thứ hai và thứ ba, tương ñương với pha loãng ñến nồng ñộ 10-6. Sau khi trang xong dùng giấy gói lại và chuyển các hộp pettri chứa VSV vào tủ ấm và nuôi ở nhiệt ñộ thích hợp.
Sau khoảng 2 – 4 ngày nuôi cấy, lấy ra quan sát, mô tả và chụp ảnh khuẩn lạc mọc trên các hộp pettrị
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 30
b. Ảnh hưởng của một số ñiều kiện môi trường ñến sinh trưởng, phát triển và khả năng phòng chống bệnh ñốm nâu cây chè của các chủng VKðK.