Ch−ơng 1 Tổng quan
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu về thực vật
Các nội dung nghiên cứu cơ bản về thực vật gồm có:
- Khẳng định về tên khoa học và mô tả đặc điểm hình thái của bốn lồi kể trên.
- Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD-PCR) để góp phần phục vụ cho công tác phân loại cũng nh− định h−ớng sử dụng trong công tác kiểm định d−ợc liệu trong t−ơng lai.
- Tái điều tra một số điểm phân bố đã biết, đồng thời mở rộng điều tra các khu vực lân cận và các vùng khác. Kết hợp với các t− liệu đã công bố nhằm xác định cụ thể về phân bố của mỗi loài ở Việt Nam hiện nay và thể hiện trên bản đồ phân bố điểm.
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh thái cơ bản, nh− tính −a sáng, chịu bóng, −a ẩm, mơ tả sơ bộ mơi tr−ờng nơi mọc và đặc điểm khí hậu ở các điểm phân bố chủ yếu của các đối t−ợng nghiên cứu.
- Quan sát, thu thập dẫn liệu để mơ tả khái qt q trình sinh tr−ởng và phát triển tự nhiên của bốn loài.
2.2.2. Nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học
Thành phần hóa học của bốn lồi cây thuốc đ−ợc phân tích với hai nội dung chính:
- Xác định một số nhóm hoạt chất chủ yếu của mỗi loài và so sánh giữa các lồi.
- Xác định dấu vân tay hóa học góp phần phân biệt d−ợc liệu thu đ−ợc từ các loài.
2.2.3. Nghiên cứu bảo tồn
2.2.3.1. Bảo tồn tại chỗ (in situ)
Qua điều tra, lựa chọn mỗi loài hoặc cả hai loài (Sâm vũ diệp và Tam thất hoang) một điểm có cây mọc tự nhiên t−ơng đối tập trung. Tiến hành theo dõi th−ờng xuyên về sự sinh tr−ởng và phát triển của chúng nhằm mục đích bảo tồn nguyên vẹn, lâu dài các cá thể hiện có.
2.2.3.2. Bảo tồn chuyển chỗ (ex situ)
Tiến hành trồng tại các v−ờn thí nghiệm và đ−a vào trồng với mục đích bảo tồn trong cộng đồng. Theo dõi sự sinh tr−ởng và phát triển nhằm thu thập những dẫn liệu khoa học. Kết hợp nghiên cứu cách nhân giống của cả bốn lồi. Xây dựng đ−ợc các mơ hình bảo tồn đi đơi với phát triển trồng thêm tại chỗ bốn lồi cây thuốc thuộc diện q hiếm kể trên.
2.3. ph−ơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Ph−ơng pháp nghiên cứu thực vật
2.3.1.1. Ph−ơng pháp nghiên cứu về phân loại thực vật và chỉ thị ADN
- Xác định tên khoa học bằng ph−ơng pháp so sánh hình thái, sử dụng khóa phân loại các lồi thuộc chi Acanthopanax (Decne. & Planch.) Miq. và Panax L. trong các bộ thực vật chí hiện có [2, 37, 38, 119, 153, 155, 158].
- Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD-PCR) đ−ợc thực hiện theo ph−ơng pháp của Clark (1997) [86]. Các b−ớc xử lý, qui trình tách chiết ADN, phân tích ADN tổng số (ADNts) đ−ợc trình bày ở phụ lục 2.
2.3.1.2. Ph−ơng pháp điều tra phân bố và nghiên cứu đặc điểm sinh thái
- Thực hiện theo "Qui trình điều tra d−ợc liệu" của Bộ Y tế năm 1973 và Ph−ơng pháp điều tra và nghiên cứu bảo tồn cây thuốc của Nguyễn Tập (2006) [10, 62]. Sử dụng bản đồ địa hình 1 / 50.000 và máy định vị vệ tinh (GPS) để xác định toạ độ địa lý các điểm phân bố.
- Ph−ơng pháp nghiên cứu sinh thái thực vật theo D−ơng Hữu Thời (1963) [67].
2.3.2. Ph−ơng pháp khảo sát sơ bộ thành phần hoá học
- Chiết xuất, phân tích hố học đ−ợc th−ợc hiện trên cơ sở các nguyên tắc và ph−ơng pháp sàng lọc các nhóm hoạt chất tự nhiên của Nguyễn Văn Bàn (1996) và Nguyễn Văn Đàn (1985) [3, 27].
- Phân tích tinh dầu lá các lồi bằng ph−ơng pháp sắc ký khí khối phổ. Dựa vào th− viện phổ để xác định các thành phần hoạt chất trong tinh dầu.
- Xác định dấu vân tay hóa học bằng ph−ơng pháp sắc ký lỏng cao áp
(SKLCA, còn gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao) đ−ợc mô tả tại chuyên luận “Ph−ơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”, PL84, phụ lục 4, DĐVN III [14]. Qui trình phân tích có thể tóm tắt nh− sau:
+ Đối với Ngũ gia bì h−ơng và Ngũ gia bì gai: Các chất đ−ợc tách chiết từ vỏ rễ Ngũ gia bì h−ơng và Ngũ gia bì gai gồm các phenylpropanoid (nh− syringin), acid cafeic, sinapyl alcol, lignan, saponin ... theo các qui trình đ−ợc mơ tả tr−ớc đây [133, 139, 147]. Thành phần dịch chiết đ−ợc phân tích bằng kỹ thuật SKLCA (RP-HPLC) trên cột LiChrospher RP C18 (150mm x 4,6 mm, 5àm) bởi pha động gồm dung môi A (acid phosphoric 0,5%) và dung môi B (acetonitrile, ACN) theo h−ớng rửa giải gradient (từ phút 0 → 40, dung môi A giảm dần từ 98 → 70%, dung môi B tăng dần từ 2 → 30%; từ phút 40
→ 50, dung môi A tăng từ 70 → 98%, dung môi B giảm từ 30 → 2%). Thể
tích bơm mẫu là 10 àl đ−ợc phân tách với tốc độ dòng pha động là 1ml/phút ở nhiệt độ phòng trong 50 phút. B−ớc sóng phát hiện là 220 nm bởi detector diod array (DAD). Mẫu đối chiếu là syringin chuẩn (40àg/ml methanol).
+ Đối với Sâm vũ diệp và Tam thất hoang: Qui trình chiết xuất và phân tích SKLCA về cơ bản giống với Ngũ gia bì h−ơng và Ngũ gia bì gai. Chỉ khác là nguyên liệu chiết xuất là từ thân rễ; thời gian l−u mẫu qua cột giảm xuống 45 phút, b−ớc sóng phát hiện ở 254 nm. Ngoài ra, chế độ rửa giải gradient dung mơi có thay đổi cho phù hợp với mẫu phân tích, cụ thể là từ
phút 0 → 40, dung môi A (acid phosphoric 0,5%) giảm từ 80 → 70%, dung
môi B (ACN) tăng từ 20 → 30%; còn từ phút 40 → 45, dung môi A tăng từ 70
→ 80% và dung môi B giảm từ 30 → 20%. Các điều kiện khác, bao gồm pha
tĩnh (cột HPLC), tốc độ dịng, nhiệt độ, thể tích tiêm mẫu, DAD ... đ−ợc duy trì nh− khi phân tích các dịch chiết của Ngũ gia bì h−ơng và Ngũ gia bì gai.