3.1.1.3. Sâm vũ diệp
Trên cơ sở phân tích 18 tiêu bản Sâm vũ diệp thu thập đ−ợc ở vùng Hoàng Liên Sơn (xem phụ lục 5), chúng tơi thấy chúng đều có dạng lá xẻ thùy
sâu (dạng xẻ hai lần lông chim). Qua đó, chúng tơi cũng khẳng định các mẫu
đã thu thập là thuộc loài Panax bipinnatifidus Seem. Mặt khác, khi đem đối chiếu các tiêu bản này với 8 tiêu bản thu thập tr−ớc đây mang các số hiệu 348, 3251, 3252, 3254, 3259, 3265, 911 vốn đã đ−ợc xác định tên khoa học là
Panax bipinnatifidus Seem. (xem phụ lục 9) chúng tơi thấy hồn tồn trùng
khớp, khơng có gì sai khác.
Đặc điểm hình thái lồi Sâm vũ diệp
Tên khác: Tam thất lá xẻ; Sâm hai lần chẻ (Phạm Hoàng Hộ); Phan xiết (Dao); Vũ diệp tam thất; Hoa diệp tam thất, Hoàng liên thất; Nữu tử thất; Ngật đáp thất; H−ơng sơn tam thất (Trung Quốc).
Cây thân cỏ, sống nhiều năm, cao 0,3 - 0,7 m (hình 3.4). Thân rễ (củ) mập, phân nhánh nằm ngang và có nhiều đốt và những vết sẹo to do thân cây mang lá tàn lụi, đầu rễ có hình con quay. Thân mang lá 1 - 3, tùy theo số đầu phân nhánh của thân rễ, mọc thẳng, đ−ờng kính 0,3 - 0,6 cm, có khía dọc.
Lá kép chân vịt th−ờng gồm 3 lá kép, mọc vịng; mỗi lá kép th−ờng có 5 lá chét (ít khi 3) thn, dài 10 - 25 cm, rộng 2,5 - 5 cm, gốc thuôn nhọn, đầu kéo dài thành mũi nhọn; mép lá xẻ thùy nông hay
Hình 3.4. Sâm vũ diệp
thùy sâu không đều, các thùy sâu xẻ tiếp thành thùy thứ cấp; mép có răng c−a, có lơng.
Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa dài 5 - 10 cm; đ−ờng kính tán hoa 2 - 3 cm, gồm 20 - 90 hoa; cuống hoa mảnh, dài 1 - 1,5 cm; hoa màu trắng lục; đều 5 cánh; 5 cánh hoa hình tam giác, nhọn đầu; 5 nhị; bầu 2 ơ, đầu vịi nhụy chẻ đơi.
Quả hình cầu hơi dẹt, đ−ờng kính 0,6 - 1 cm, khi chín màu đỏ, hạt 2, gần hình cầu, màu xám trắng, vỏ cứng.
3.1.1.4. Tam thất hoang
Qua nghiên cứu 17 tiêu bản Tam thất hoang thu thập đ−ợc từ năm 1999 trở lại đây (xem phụ lục 5), chúng tơi thấy các mẫu đều có thân rễ (củ) nằm ngang và có thể phân nhánh. Gốc cuống các lá chét th−ờng có loại lá tai nhỏ
và ở gốc cuống cụm hoa có các lá bắc dạng chỉ. Đối chiếu với các Khóa phân
loại chi Panax L. của Zhou J., Huang W. G., Wu M. Z. et al. (1975) [152] và
trong bản mô tả Tam thất hoang gần đây của Nguyễn Tập (2005) [59], chúng tôi xác định những tiêu bản kể trên thuộc loài Panax stipuleanatus H.T.Tsai
& K.M.Feng. Ngoài ra, khi đem so sánh những tiêu bản mới thu thập này với
các tiêu bản có tên P. stipuleanatus H.T.Tsai & K.M.Feng, mang các số hiệu
3257, 416, 1490, 1628, 1805, 1435, 1786, 3270 (xem phụ lục 10) thấy hồn tồn giống nhau, khơng có sự sai khác.
Đặc điểm hình thái lồi Tam thất hoang
Tên khác: Tam thất rừng; Phan xiết (Dao); Xán xỉ (H’Mơng); Bình biên tam thất, Thổ tam thất, H−ơng thích, Trúc tiết thất (Trung Quốc).
Cây thân cỏ, sống nhiều năm, cao 25 - 75 cm. Thân rễ mập, nằm ngang, có nhiều u lồi dính kết nhau, mặt trên có những chỗ lõm do các vết thân lụi hàng năm để lại, ít khi phân nhánh, đ−ờng kính 1,5 - 3 cm. Mỗi khóm th−ờng
có 1 thân mang lá, đơi khi 2 - 4 thân, do thân rễ bị tổn th−ơng, sau phân nhánh và mọc lên số chồi thân t−ơng ứng. Thân mọc thẳng, nhẵn, đ−ờng kính 0,3 - 0,6 cm. Lá kép chân vịt, th−ờng có 3 lá kép, mọc vịng ở ngọn, cuống dài 5 - 10 cm (hình 3.5). Mỗi lá kép có 5 lá chét, ở gốc cuống lá chét đơi khi có phần phụ dạng lá tai hoặc hình chỉ, phiến lá chét hình thn hay mác thn, nhọn hai đầu, dài 5 - 13 cm, rộng 2 - 4 cm;
mép có răng c−a, hoặc ở một số ít cây non, có thể gặp dạng lá xẻ lông chim một lần (thùy nơng), mép của thùy cũng khía răng, th−ờng có lơng ở gân lá mặt trên.
Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn, ít khi có tán phụ, đ−ờng kính tán hoa 2 - 3 cm; cuống cụm hoa dài 5 - 10 cm, bằng hoặc cao hơn lá; ở gốc cụm hoa tán th−ờng có phần phụ dạng lá rất hẹp hoặc dạng chỉ. Hoa 30 - 80 cái màu xanh vàng, 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị, bầu 2 ô, đầu nhụy th−ờng chẻ đôi.
Quả mọng, gần hình cầu dẹt, đ−ờng kính 0,6 - 1,2 cm, khi chín màu
đỏ; hạt 1 - 2, gần giống hạt đậu tròn, màu xám trắng, vỏ cứng.
3.1.2. Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD-PCR) để đánh giá sự đa dạng di truyền và góp phần phân biệt các lồi Ngũ gia bì h−ơng, Ngũ gia bì truyền và góp phần phân biệt các lồi Ngũ gia bì h−ơng, Ngũ gia bì gai, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
3.1.2.1. Kết quả tách chiết ADN
* Kết quả thu thập mẫu: chúng tôi tiến hành thu thập đ−ợc tổng số 46
mẫu của bốn lồi Ngũ gia bì h−ơng (NGBH), Ngũ gia bì gai (NGBG), Sâm vũ
Hình 3.5. Tam thất hoang
diệp (SVD) và Tam thất hoang (TTH) từ các địa điểm khác nhau để nghiên cứu tách chiết ADN (bảng 3.1).
Bảng 3.1. Danh sách và kí hiệu các mẫu thực vật sử dụng trong nghiên cứu
phân tích ADN (chỉ thị RAPD-PCR)
Tên lồi và kí hiệu
chữ cái đầu tiên Địa điểm thu thập mẫu
Số
l−ợng Kí hiệu
Thị trấn Sa Pa, Lào Cai 3 HLC1 - HLC3
Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 5 HLC4 - HLC8
Ngũ gia bì h−ơng (H)
Thị trấn Phó Bảng, Hà Giang 4 HHG1 - HHG4
Thị trấn Sa Pa, Lào Cai 4 GLC1 - GLC4
Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 2 GLC5 - GLC6
Thạch An, Cao Bằng 3 GCB1- GCB3
Tràng Định, Lạng Sơn 3 GLS1 - GLS3
Ngũ gia bì gai (G)
Văn Lãng, Lạng Sơn 2 GLS4 - GLS5
Sâm vũ diệp (V) Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 8 V1 - V8
Dạng lá xẻ nông (VT) Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 4 VT1 - VT4
Tam thất hoang (T) Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 8 T1 - T8
Các mẫu thực vật sau khi thu thập, đ−ợc loại bỏ các phần mơ có biểu hiện nhiễm bệnh, hoặc bị chết. Các mô sạch đ−ợc bảo quản ở nhiệt độ -80°C cho đến khi tiến hành quá trình tách chiết ADN và phân tích (thành phần các dung dịch sử dụng trong quá trình tách chiết đ−ợc trình bày ở phụ lục 11).
Kết quả cho thấy, tất cả các mẫu ADN tách chiết thu đ−ợc đều đảm bảo độ nguyên vẹn, không đứt gãy, đủ tiêu chuẩn làm khuôn cho các phản ứng PCR sau này (xem bảng 3.2 và 3.3, các hình 3.6 và 3.7).
Bảng 3.2. Kết quả đo quang phổ hấp thụ dịch chiết ADN tổng số của các mẫu
Ngũ gia bì h−ơng (H) và Ngũ gia bì gai (G)
Mẫu NGBH Tỉ số A260/280 Nồng độ ADN (ng/ààààl) Mẫu NGBG Tỉ số A260/280 Nồng độ ADN (ng/àààl) à HLC1 1,77 4590 GLC1 1,05 2240 HLC2 1,77 2210 GLC2 1,15 2990 HLC3 1,23 1250 GLC3 1,25 890 HLC4 1,49 6390 GLC4 1,13 7060 HLC5 1,51 4585 GLC5 1,24 2455 HLC6 1,57 8065 GLC6 1,56 890 HLC7 1,76 7035 GCB1 1,17 6965 HLC8 1,77 3540 GCB2 1,15 7485 HHG1 1,19 1450 GCB3 1,11 3065 HHG2 1,22 3828 GLS1 1,13 3260 HHG3 1,24 2334 GLS2 1,22 385 HHG4 1,22 1310 GLS3 1,02 425 GLS4 1,12 2680 GLS5 1,11 4140
LC: Lào Cai, CB: Cao Bằng, LS: Lạng Sơn, HG: Hà Giang; Các chữ số (1 - 8) chỉ các địa điểm thu mẫu khác nhau
Hình 3.6. ảnh điện di ADN tổng số các mẫu Ngũ gia bì h−ơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) M: Thang ADN chuẩn kích th−ớc 1 Kb; LC: Lào Cai, CB: Cao Bằng, LS: Lạng Sơn,
Bảng 3.3. Kết quả đo mật độ quang phổ hấp thụ dịch chiết ADN tổng số của
các mẫu Sâm vũ diệp (V), Tam thất hoang (T) và dạng lá xẻ nông (VT)
Mẫu SVD Tỉ số A260/280 Nồng độ ADN (ng/ààààl) Mẫu TTH Tỉ số A260/280 Nồng độ ADN (ng/àààl) à V1 2,01 1595 T1 1,53 1125 V2 1,95 1570 T2 1,64 1540 V3 2,08 3315 T3 1,77 2195 V4 2,04 2055 T4 1,65 2075 V5 1,96 775 T5 1,67 1525 V6 2,02 2640 T6 1,72 1305 V7 2,03 2345 T7 1,83 1400 V8 2,08 2930 T8 1,90 2425 Mẫu dạng lá xẻ nông VT1 1,89 1595 VT2 1,88 1195 VT3 1,79 1035 VT4 1,93 995
Các chữ số (1 - 8) chỉ các địa điểm thu mẫu khác nhau
Hình 3.7. ảnh điện di ADN tổng số các mẫu Sâm vũ diệp (V), Tam thất hoang (T)
và dạng lá xẻ nông (VT)
M: Thang ADN chuẩn kích th−ớc 1Kb; Các chữ số (1 - 8) chỉ các địa điểm thu mẫu khác nhau
3.1.2.2. Sử dụng chỉ thị RAPD-PCR để đánh giá sự đa dạng di truyền * Ngũ gia bì h−ơng và Ngũ gia bì gai * Ngũ gia bì h−ơng và Ngũ gia bì gai
Tổng cộng 16 mồi ngẫu nhiên đã đ−ợc sử đụng để phân tích cấu trúc di truyền của 12 mẫu Ngũ gia bì h−ơng và 14 mẫu Ngũ gia bì gai. Kết quả đ−ợc trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Số băng RAPD-PCR đa hình của các mẫu thuộc hai lồi Ngũ gia bì
h−ơng và Ngũ gia bì gai phân tích với 16 mồi ngẫu nhiên
Số băng đa hình/ Tổng số băng Mồi Trình tự mồi NGBH NGBG Tổng số băng tính cả 2 lồi OPA 1 5’-CAGGCCCTTC-3’ 6/10 4/8 14 OPA 4 5’-GGGTAACGCC-3’ 2/6 6/9 12 OPA 5 5’-AGGGGTCTTG-3’ 0/2 0/2 2 OPA 9 5’-GGGTAACGCC-3’ 3/6 7/8 13 OPA 10 5’-GTGATCGCAG-3’ 7/9 7/8 11 OPA 12 5’-TCGGCGATAG-3’ 5/8 3/6 10 OPA 13 5’-CAGCACCCAC-3’ 4/7 7/8 9 OPA 15 5’-TTCCGAACCC- ‘ 7/10 5/10 15 OPA 17 5’-GACCGCTTGT-3’ 14/15 13/14 17 OPC 1 5’-TTCGAGCCAG-3’ 4/6 1/2 5 OPC 3 5’-GGGGGTCTTT-3’ 4/6 1/3 6 OPC 5 5’-GATGACCGCC-3’ 7/8 5/8 11 OPC 7 5’-GTCCCGACGA-3’ 7/9 3/5 9 OPC 9 5’-CTCACCGTCC-3’ 10/10 17/17 19 OPC 19 5’-GTTGCCAGCC-3’ 6/8 9/11 13 OPC 20 5’-ACTTCGCCAC-3’ 4/5 7/7 9 Tổng số (72,00%) 90/125 95/126 (75,40%) 157 Trung bình 5,6/7,8 5,9/7,8 9,8
Kết quả cho thấy, tổng số băng RAPD khuếch đại đ−ợc là 157 băng, trong đó có 125 băng xuất hiện ở lồi Ngũ gia bì h−ơng và 126 băng xuất hiện ở lồi Ngũ gia bì gai, trung bình mỗi mồi khuếch đại đ−ợc 7,8 băng. Phân tích 12 mẫu thuộc lồi Ngũ gia bì h−ơng xuất hiện 90 băng đa hình trong tổng số 125 băng khuếch đại đ−ợc, chiếm 72%. Đối với 14 mẫu Ngũ gia bì gai thu đ−ợc 95 băng đa hình trong tổng số 126 băng khuếch đại đ−ợc. Tức là số băng đa hình chiếm 75,4% tổng số băng. Nh− vậy các tập hợp cá thể của hai lồi Ngũ gia bì h−ơng và Ngũ gia bì gai ở Việt nam có mức độ đa hình di truyền t−ơng đối cao.
Các số liệu thu đ−ợc ở bảng 3.4 và hình 3.8 và 3.9 cũng cho thấy, trong 16 mồi ngẫu nhiên sử dụng phân tích, đa số các mồi cho kết quả thể hiện tính đa hình cao, đặc biệt là các mồi OPC9, OPA17, OPA1, OPC19. Riêng với mồi OPC9, tồn bộ 14 mẫu Ngũ gia bì gai và 12 mẫu Ngũ gia bì h−ơng đều cho phổ điện di sản phẩm PCR khác nhau, thể hiện sự đa hình cao của các mẫu, và đây cũng là mồi cho số băng đa hình cao nhất (19 băng). Thêm vào đó, đối với mồi OPC9, các phổ điện di cũng cho thấy sự khác biệt rõ nét giữa 2 thứ của lồi Ngũ gia bì gai.
Hình 3.8. ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gai bì h−ơng (H) và
Ngũ gia bì gai (G) đ−ợc khuếch đại bằng mồi OPC9
M: Thang ADN chuẩn kích th−ớc 1 Kb, LC: Lào Cai, CB: Cao Bằng, LS: Lạng Sơn, HG: Hà Giang; Các chữ số (1 - 8) chỉ các địa điểm thu mẫu khác nhau
Tuy nhiên có một số mồi thể hiện đa hình khơng cao. Chẳng hạn nh− mồi OPA5 biểu hiện tính đồng hình 100% ở tất cả các mẫu nghiên cứu thuộc cả hai lồi. Đây cũng là mồi cho số băng RAPD-PCR ít nhất trong số 16 mồi phân tích. Với tất cả các mẫu chỉ thu đ−ợc 2 băng đồng hình (hình 3.9).
Kết quả phân tích cho thấy, mặc dù lồi Ngũ gia bì h−ơng chỉ cịn tập hợp một số ít nhóm các cá thể nh−ng mức độ đa dạng di truyền của loài này cũng khá cao (xem phụ lục 12). Ngoại trừ mồi OPA5, hầu hết các mồi đều xuất hiện các băng đa hình. Điều này chứng tỏ Ngũ gia bì h−ơng có nhiều kiểu di truyền khác nhau và việc bảo tồn các quần thể cịn xót lại là hết sức cần thiết.
Cịn đối với lồi Ngũ gia bì gai, mức độ đa dạng di truyền đối với các mẫu ở các địa ph−ơng khác nhau cũng khác nhau (xem phụ lục 13). Các mẫu quần thể ở hai tỉnh Lào Cai và Cao Bằng có mức độ đa dạng di truyền cao hơn so với các mẫu thu tại Lạng Sơn. Số băng đa hình trung bình thu đ−ợc từ các mẫu ở các tỉnh Lào Cai, Cao Bằng và Lạng Sơn lần l−ợt là 4,3; 4,1 và 2,8 băng trên tổng số băng trung bình thu đ−ợc là 7,8 băng. Sự đa dạng di truyền của lồi Ngũ gia bì gai ở các địa ph−ơng thu thập mẫu (Lào Cai, Cao Bằng và
Hình 3.9. ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu
Ngũ gia bì h−ơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) đ−ợc khuếch đại bằng mồi OPA5
M: Thang ADN chuẩn kích th−ớc 1 Kb; LC: Lào Cai, CB: Cao Bằng, LS: Lạng Sơn, HG: Hà Giang; Các chữ số (1 - 5) chỉ các địa điểm thu mẫu khác nhau
Lạng Sơn) cịn đ−ợc thể hiện qua việc khơng tìm thấy một chỉ thị RAPD-PCR đồng hình nào xét trong từng nhóm mẫu đ−ợc thu thập tại mỗi địa ph−ơng.
Xử lý số liệu bằng phần mềm NTSYS-pc 2.02h, đã xác định đ−ợc hệ số t−ơng đồng di truyền (bảng 3.5) và xây dựng đ−ợc sơ đồ hình cây quan hệ di truyền giữa 14 mẫu Ngũ gia bì gai và 12 mẫu Ngũ gia bì h−ơng (hình 3.10). Từ sơ đồ hình cây quan hệ di truyền, có thể nhận thấy sự khác biệt khá rõ về cấu trúc di truyền giữa hai loài Ngũ gia bì h−ơng và Ngũ gia bì gai. Các mẫu thuộc hai lồi tách thành hai nhóm rõ rệt, với hệ số khoảng cách di truyền giữa chúng là khoảng 0,5. Trong phạm vi mỗi loài, hệ số t−ơng đồng di truyền giữa các mẫu cũng cho thấy tính đa dạng di truyền t−ơng đối cao ở mỗi loài. Hệ số này giữa các mẫu thuộc lồi Ngũ gia bì gai dao động từ 0,62 đến 0,92, cịn đối với các mẫu Ngũ gia bì h−ơng là từ 0,67 đến 0,95.
Đối với lồi Ngũ gia bì h−ơng, các cặp mẫu có hệ số t−ơng đồng di truyền cao nhất (0,95) là giữa cặp mẫu HHG1 và HHG2 (đều thu ở Hà Giang), và
cặp mẫu HLC1 (thu ở Lào Cai) và HHG4 (thu ở Hà Giang). Các mẫu thu thập
đ−ợc có tính đa hình t−ơng đối cao. Dựa vào Cây quan hệ di truyền cho thấy, các cá thể Ngũ gia bì h−ơng phân thành 3 nhóm tách biệt về cấu trúc di truyền. Nhóm thứ nhất bao gồm các mẫu HLC4, HLC5 và HLC6 (tất cả đều đ−ợc thu ở Lào Cai). Nhóm thứ hai gồm các mẫu HLC7, HLC8, HLC1 và HHG4 (gồm 3 mẫu thu ở Lào Cai, và 1 mẫu thu ở Hà Giang). Nhóm thứ ba gồm các mẫu HLC2, HLC3, HHG1, HHG2 và HHG3 (gồm 2 mẫu thu ở Lào Cai, và 3 mẫu thu ở Hà Giang). Kết quả này cho thấy có thể có sự liên hệ nào đó về nguồn gốc của các mẫu Ngũ gia bì H−ơng thu ở Lào Cai và Hà giang. Mặt khác, khi xét trong phạm vi các mẫu Ngũ gia bì h−ơng thu ở Lào Cai, chúng tơi nhận thấy chúng phân tách thành hai nhóm. Một nhóm tách biệt gồm 3 mẫu thu ở Lào Cai là HLC4, HLC5 và HLC6. Nhóm các mẫu thu ở Lào Cai cịn lại (HLC1, HLC2, HLC3, HLC7 và HLC8) có cấu trúc di truyền gần hơn với các mẫu thu ở Hà Giang.
Điều này cũng hồn tồn phù hợp vì các mẫu này có nguồn gốc từ Hà Giang (lấy nguyên liệu từ Hà Giang về nhân giống và trồng ở Lào Cai).
Khi so sánh giữa các mẫu thuộc lồi Ngũ gia bì gai có địa điểm phân bố gần nhau t−ơng ứng tại các tỉnh Lào Cai, Cao Bằng và Lạng Sơn, hệ số t−ơng đồng di truyền của các mẫu t−ơng ứng là 0,78; 0,69 và 0,84. Trong số