- Phổ hồng ngoại được ghi trên máy Impact 410Nicolet FTIR hoặc trên máy Horiba FT
b. Phân tách phần chiết n-hexan từ thân rễ cây Riềng maclure
Phần chiết n-hexan MH (10 g) được phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel (0,063- 0,200 mm), hệ dung môi građien n-hexan-etyl axetat 70:1, 49:1 và 19:1, thu được 52 phân đoạn (mỗi phân đoạn 20 ml) và gộp thành 5 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ MH1 đến MH5. Nhóm phân đoạn MH5 (3,49 g) được phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel (0,063-0,100 mm), hệ dung môi građien n-hexan-diclometan 19:1, 9:1, 3:1, 2:1 và 1:1 cho M1 (17,8 mg).
3.4.3.2 Phân tách phần chiết diclometan từ thân rễ cây Riềng maclurei
Phần chiết diclometan từ thân rễ cây Riềng maclurei (MD, 40 g) được phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel (0,063-0,200 mm), hệ dung môi n-hexan-etyl axetat 29:1, 15:1, 9:1, 4:1, 2:1, 1:1 và 1:2, thu được 60 phân đoạn (mỗi phân đoạn 150 ml) và gộp thành 7 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ MD1 đến MD7.
Nhóm phân đoạn MD3 (2,59 g) được phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel (0,063- 0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-etyl axetat 49:1, 19:1 và 9:1 cho M1 (250 mg). MD4 (3,33 g) được phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel (0,063-0,100 mm), hệ dung môi n-hexan-etyl
axetat 49:1, 19:1, 9:1, 4:1 và 2:1, thu được 8 nhóm phân đoạn từ MD4.1 đến MD4.8.
Các nhóm phân đoạn MD4.2 (0,29 g) và MD4.4 (0,23 g) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột FC trên silica gel (0,015-0,040 mm) với các hệ dung môi tương ứng n-hexan-diclometan 9:1, 4:1 và
69
được phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel (0,040-0,063 mm), hệ dung môi n-hexan-etyl
axetat 9:1, 4:1, 2:1 và 1:1, thu được 5 nhóm phân đoạn từ MD6.1 đến MD6.5. MD6.4 (8,5 g) được phân tách tiếp 2 lần bằng sắc ký cột FC trên silica gel (0,040-0,063 mm), hệ dung môi n-hexan-
axeton 9:1-1:2 và n-hexan-etyl axetat 2:1 cho MA (37,9 mg). MD6.5 (1,2 g) được kết tinh lại trong metanol cho M4 (17,9 mg).
Quá trình phân tách phần chiết diclometan từ thân rễ cây Riềng maclurei được trình bày trên Sơ đồ 3.21.
Sơ đồ 3.21: Phân tách phần chiết diclometan từ thân rễ cây Riềng maclurei
3.4.3.3 Phân tách phần chiết etyl axetat từ thân rễ cây Riềng maclurei
Phần chiết etyl axetat từ thân rễ cây Riềng maclurei (ME, 20 g) được phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel (0,063-0,200 mm), hệ dung mơi diclometan-axeton 6:1,
4:1, 2:1, thu được 7 nhóm phân đoạn từ ME1 đến ME7.
Nhóm phân đoạn ME5 được rửa bằng axeton cho M4 (45,4 mg). Nhóm phân đoạn ME7 được phân tách bằng sắc ký cột FC trên silica gel (0,040-0,063 mm), hệ dung môi diclometan- metanol 15:1, 9:1, 6:1 và 4:1, sau đó kết tinh lại trong hỗn hợp dung mơi diclometan-methanol cho
M5 (7,9 mg).
Quá trình phân tách phần chiết etyl axetat từ thân rễ cây Riềng maclurei được trình bày trên Sơ đồ 3.22. MD1-2 1,98 g CC, Si gel, H/E 9:1→1:1 CC, Si gel, H/E 29:1→1:2 MD(40 g) MD4 3,33 g MD5 6,4 g MD6 14,54 g MD7 3,0 g MA 37,9 mg mg M1 250 mg CC, Si gel, H/E 49:1→9:1 CC, Si gel, H/E 49:1→2:1 M2 50,5 mg M3 29,6 mg FC, Si gel, H/D 9:1→ 4:1 M4 17,9 mg MD3 2,59 g FC, Si gel,
H/A 15:1→9:1 FC, Si gel, H/A 9:1→1:2 FC, Si gel, H/E 2:1
ME1 0,78 g g Rửa axeton CC, Si gel, D/A 6:1→2:1 ME(20 g) ME4 2,27 g ME5 3,02 g ME6 5,12 g ME7 3,59 g M4 45,4 mg mg M5 7,9 mg ME2 1,06 g g ME3 1,13 g FC, Si gel, D/M 15:1→4:1 Kết tinh lại
Sơ đồ 3.22: Phân tách phần chiết etyl axetat từ thân rễ cây Riềng maclurei
3.4.4 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập đƣợc từ thân rễ cây Riềng maclurei maclurei
♦ M1 (β-Sitosterol) (xem A21) ♦ M2 (Axit palmitic)
Bột vơ định hình màu trắng, đ.n.c. 59-60 o
C,
Rf = 0,39 (TLC, silica gel, n-hexan-etyl axetat 4:1, v/v).
EI-MS: m/z (%) 256 (M+·, C16H32O2, 22), 239 (4), 213 (11), 227 (3), 114 (5), 185 (11), 171 (10), 157 (11), 143 (7), 129 (5), 115 (14), 97 (23), 83 (32), 73 (100), 60 (44).
♦ M3 (Alpininon)
Tinh thể hình kim màu vàng, đ.n.c. 264-265 o
C,
Rf = 0,45 (TLC, silica gel, n-hexan-etyl axetat 4:1, v/v).
1H-NMR (CDCl3): δ 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, 10-CH3), 1,28-1,34 (8H, m, 2H-6, 2H-7, 2H- 8, 2H-9), 1,66 (2H, quintet, J = 7,0 Hz, H-5), 2,65 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-4), 6,62 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-2), 6,89 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3ʹ, H-5ʹ), 7,45 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2ʹ, H- 6ʹ), 7,53 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-1). 13 C-NMR (CDCl3): δ 14,1 (q, C-10), 22,6 (t, C-9), 24,7 (t, C-5), 29,1 (t, C-7), 29,3 (t, C-6), 31,7 (t, C-8), 40,8 (t, C-4), 116,1 (d, C-3ʹ, C-5ʹ), 123,7 (d, C-2), 126,9 (s, C-1ʹ), 130,2 (d, C-2ʹ, C-6ʹ), 143,0 (d, C-1), 158,5 (s, C-4ʹ), 201,9 (C-3). ♦ M4 (Naringenin 5-O-metyl ete)
Bột vơ định hình màu vàng nhạt, đ.n.c. 265-266 o
C, Rf = 0,3 (TLC, silica gel, n-hexan-etyl axetat 2:3, v/v).
1H-NMR (CD3OD + CDCl3): δ 2,67 (1H, dd, J = 15,0 Hz, 3,0 Hz, H-3a), 2,97 (1H, dd, J =
17,0 Hz, 3,0 Hz, H-3b), 3,84 (3H, s, 5-OCH3), 5,31 (1H, dd, J = 13,0 Hz, 3,0 Hz, H-2), 6,06 (1H, d,
J = 2,0 Hz, H-6), 6,08 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,83 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2ʹ, H-6ʹ), 7,30 (2H, d, J
= 8,5 Hz, H-3ʹ, H-5ʹ).
♦ M5 (β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranozit) Tinh thể hình que màu trắng, đ.n.c. 280-281 o
C,
Rf = 0,40 (TLC, silica gel, diclometan-metanol 9:1, v/v).
1H-NMR (CD3OD): δ 0,68 (3H, s, 10-CH3), 0,82 (3H, d, J = 7,5 Hz, 25-CH3), 0,83 (3H, d,
J = 7,5 Hz, 25-CH3), 0,87 (3H, t, J = 7,5 Hz, 28-CH3), 0,95 (3H, s, 20-CH3), 1,01 (3H, s, 13-CH3),
3,2-3,6 (6H, m, H-2ʹ, H-3ʹ, H-4ʹ, H-5ʹ, 2H-6ʹ), 3,77 (1H, dd, J = 11,5 Hz, 5,0 Hz, H-3), 4,41 (1H, d,
J = 7,5 Hz, H-1ʹ), 5,36 (1H, br s, H-6).
3.5 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
71
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp hiện đại của Vanden Berghe và Vlietinck (1991), và L. Mc Kane & Kandel (1996) [153, 154]. Các chủng vi sinh vật kiểm định gồm:
Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923) Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtilis (ATCC 27212)
Staphylococcus aureus (ATCC 12222) Nấm sợi: Aspergillus niger (439)
Fusarium oxysporum (M42) Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754)
Saccharomyces cerevisiae (SH 20)
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
- Mơi trường duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth (SDB, Sigma, Hoa Kỳ) cho nấm men và nấm mốc, Trypcase Soya Broth (TSB, Sigma) cho vi khuẩn.
- Mơi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Hoa Kỳ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Hoa Kỳ) cho vi nấm.
Tiến hành thí nghiệm:
Các chủng kiểm định được hoạt hố và pha lỗng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm.
Cách thử: Mẫu thử được hoà tan hoàn toàn trong dung dịch DMSO 100% bằng máy
Vortex với nồng độ thích hợp rồi lọc qua màng lọc microfilter (0,02 μm), thu được dung dịch gốc. Nhỏ dung dịch gốc vào phiến vi lượng 96 giếng, nhỏ dịch chứa vi sinh vật đã được hoạt hoá vào mỗi giếng đã có mẫu sẵn.
Đối chứng dương: + Ampicilin cho vi khuẩn Gr (+) + Tetracylin cho vi khuẩn Gr (-)
+ Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men.
Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp: Ampicilin: 50 mM, Tetracylin: 10 mM, Nystatin: 0,04 mM.
Các giá trị MIC của đối chứng: Ampicilin 21,83 μg/ml, tetracylin 6,87 μg/ml, nystatin 1,44 μg/ml (nấm men) và 2,89 μg/ml (nấm mốc).
Đối chứng âm: Vi sinh vật không trộn kháng sinh và chất thử.
Đọc kết quả: Kết quả được đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37 oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30 oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men. Kết quả dương tính là nồng độ mà ở đó khơng có vi sinh vật phát triển. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên mơi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU < 5.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minium Inhibitory Concentration) của chất có hoạt tính:
Các mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ban đầu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ (5-10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hồn tồn. Mẫu thơ có MIC ≤ 200 μg/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50 μg/ml là có hoạt tính. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm được ghi trong Bảng 4.5, Phần kết quả và Thảo luận.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 NGHIÊN CỨU HOÁ HỌC CÂY TỐNG QUÁN SỦI (ALNUS NEPALENSIS D. Don) 4.1.1 Nguyên liệu thực vật 4.1.1 Nguyên liệu thực vật
Nguyên liệu thực vật bao gồm: lá, cành con và vỏ cành của cây Tống quán sủi (Alnus
nepalensis D. Don). Mẫu thực vật được TS Trần Ngọc Ninh, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, giám định và thu thập tại huyện Đồng Văn, tỉnh Hà Giang vào tháng 7 năm 2006 (mẫu 1) và tháng 6 năm 2007 (mẫu 2). Tiêu bản mẫu cây được lưu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số hiệu mẫu 399. Quá trình xử lý mẫu được nêu cụ thể trong mục 3.1.1, Phần thực nghiệm.
4.1.2 Điều chế các phần chiết từ lá, cành con và vỏ cành
Các mẫu lá, cành con và vỏ cành của cây Tống quán sủi được ngâm chiết riêng rẽ bằng metanol ở nhiệt độ phịng. Dịch ngâm chiết được cất loại dung mơi, rồi pha thêm nước cất và tiến hành phân bố hai pha lỏng lần lượt với n-hexan, diclometan, etyl axetat và hoặc n-butanol để thu các phần chiết tương ứng.
73
Bảng 4.1: Khối lượng mẫu khô và hiệu suất thu nhận a) các phần chiết từ cây Tống quán sủi
Mẫu 1
Lá: 0,62 kg; Cành: 0,16 kg; Vỏ: 0,14 kg
Mẫu 2
Lá: 1,48 kg; Cành: 0,45 kg; Vỏ: 1,10 kg
Phần chiết Khối lượng (g) Hiệu suất(%) Phần chiết Khối lượng (g) Hiệu suất(%)
ALHI 22,8 3,68 ALHII 56,6 3,82 ALDII 20,48 1,38 ALEI 8,1 1,31 ALEII 40,88 2,76 ALBII 2,0 0,13 ACHI 1,30 0,81 ACHII 18,9 4,19 ACDI 1,21 0,76 ACDII 12,9 2,87 ACEI 0,69 0,43 ACEII 15,6 3,46 AVHI 1,46 1,04 AVHII 13,3 1,20 AVDI 1,40 1,00 AVDII 9,4 0,85 AVEI 1,65 1,18 AVEII 8,94 0,81