CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phác đồ nghiên cứu của luận án
Cách tiếp cận và giải quyết các vấn đề nghiên cứu của luận án đƣợc thể hiện trên hình 2.3. Thu mẫu Phân tích Đặc điểm về số lượng/mật độ: - Mật độ VK tổng số - Tỷ lệ nhóm hình thái VK - Mật độ VK dị dưỡng tổng số - Mật độ nhóm Vibrio - Số đơn vị phân loại (OTU)
Đặc điểm về thành phần:
-Đơn vị phân loại phân tử (OUT)
-Thông tin về phân loại
Đặc điểm về hoạt động:
- Hô hấp
- Chuyển hóa chất hữu cơ
Đo và phân tích 4 1 3 2 Kiến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo
Vấn đề còn tồn tại Tương tác Tương tác Kết quả luận án SH bị bệnh SH kh ỏ e Quần xã vi rút Đặc điểm: - Mật độ vi rút Đặc điểm: - Các thơng số lý hóanước Trả lời cho vấn đề số 4 Trả lời cho vấn đề số 1 Trả lời cho vấn đề số 3 Trả lời cho vấn đề số 2 Nước MT xung quanh Dịch nhầy san hô khỏe mạnh
Dịch nhầy san hô bị bệnh
Quần xã vi khuẩn
2.2.2. Phương pháp thu và xử lý mẫu ngoài thực địa
Đo nhanh các thông số môi trƣờng, thu mẫu và bảo quản mẫu vật phân tích theo QA/QC (quy định của Cục Bảo vệ Môi trƣờng, Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trƣờng, 2002). Các phƣơng pháp đo cụ thể nhƣ sau:
- Phương pháp đo các thông số môi trường:
+ Các thông số nhiệt độ, độ muối, độ đục, nồng độ chlorophyll a đƣợc đo trực tiếp tại thực địa bằng máy CTD (Nhật). Riêng độ muối (S‰) đƣợc đo kiểm chứng bằng máy khúc xạ kế cầm tay (Hand Refrectometer)
- Mẫu nước được thu bằng dụng cụ chuyên dụng (chai Niskin) và lặn với khí tài SCUBA để phân tích các muối dinh dưỡng trong mơi trường nước:
+ Mẫu nƣớc để phân tích các thơng số hóa học đƣợc chiết từ Bathomet và chai nhựa vào các chai sạch đã ghi nhãn, tùy thuộc vào từng loại mẫu mà chúng đƣợc cố định hóa chất hoặc bảo quản ngay trong điều kiện lạnh (4o
C). + Mẫu nƣớc để phân tích vi sinh vật đƣợc thu bằng xylanh 50 ml vô trùng bằng phƣơng pháp lặn với khí tài SCUBA, chiết vào trong các lọ nhựa vơ trùng với thể tích khác nhau.
- Thu mẫu san hơ cho phân tích vi sinh vật:
San hô đƣợc quan sát, chụp ảnh, ghi các đặc điểm và thu mẫu. Các mẫu san hơ đƣợc thu chất nhầy ngay ngồi thực địa theo phƣơng pháp đƣợc mô tả trong công bố của Garren và Azam (2010): san hô thu lên đƣợc để lộ ra ngồi khơng khí, theo phản xạ thì san hơ tiết chất nhầy để bảo đảm độ ẩm ƣớt cho cơ thể, đợi khoảng 4 ÷ 6 phút để loại bỏ chất nhầy còn lẫn nƣớc, khi chất nhầy tinh khiết tiết ra đã đƣợc chiết trực tiếp vào ống nhựa vô trùng, bảo quản 4oC và tiến hành xử lý trong vịng 4 giờ. Hình ảnh của các hoạt động thu mẫu đƣợc thể hiện trên Hình 2.4.
Hình 2.4. Thu mẫu nƣớc, san hơ và chất nhầy của san hơ ngồi thực địa - Xử lý mẫu ngoài hiện trường:
Mẫu dùng cho phân tích bằng phƣơng pháp PCR-DGGE đã đƣợc lọc ngay bằng màng lọc polycarbonate với kích thƣớc lỗ là 0,2 µm (thể tích lọc là 2ml đối với mẫu chất nhầy san hơ và 50 ml đối với mẫu nƣớc), sau đó màng đƣợc hong khơ và gói trong giấy bạc đã đƣợc ghi nhãn, và bảo quản trong điều kiện lạnh -80o
C cho tới khi phân tích.
Mẫu định lƣợng và nghiên cứu hình thái vi sinh vật bằng phƣơng pháp nhuộm phân tử (SYBR Gold), mẫu đƣợc cố định với formadehyde đã lọc qua màng 0,02 µm với nồng độ cuối là 2% ngay sau khi thu mẫu, đông lạnh lập tức bằng nitơ lỏng (-196oC) và bảo quản ở điều kiện -80°C cho tới khi phân tích.
Mẫu dùng cho thí nghiệm bằng phƣơng pháp Biolog Ecoplate và phân tích, định lƣợng các nhóm vi khuẩn bằng các phƣơng pháp ni cấy trên mơi trƣờng chọn lọc thì đƣợc bảo quản trong điều kiện mát (khoảng 40
C) và thí nghiệm đƣợc thực hiện ngay (trong vòng trƣớc 4 giờ sau khi thu mẫu) tại phịng thí nghiệm ngồi thực địa.
Mẫu dùng cho xác định tỉ lệ tế bào vi khuẩn có hoạt động hơ hấp thơng qua máy đếm dòng tế bào (Flow Cytometry), 300 µl nƣớc biển hoặc chất nhầy san hô đƣợc nuôi trong thời gian 1 giờ, ở nhiệt độ khoảng 27oC với 30 µl dung dịch 5-cyano-2, 3-ditolyl tetrazolium clorua (CTC, tebu-bio SAS, nồng độ cuối 5 mM), chỉ thị cho hoạt động của hệ thống vận chuyển electron hô hấp (Sherr, 1999). Sau khi ủ 1 giờ thì các mẫu đƣợc cố định với formaldehyde (với nồng độ cuối là 2%), đông lạnh ngay bằng nitơ lỏng (- 196oC) và bảo quản ở điều kiện -80°C cho tới khi phân tích.
2.2.3. Phương pháp phân tích chất lượng nước
Các chất dinh dƣỡng [phosphate (PO43-), nitrite (NO2-), nitrate (NO3-), amoni (NH4+), chất hữu cơ tổng số] đƣợc xác định nồng độ bằng phƣơng pháp so mầu trên quang phổ kế DR/2000 (hãng HACH, Mỹ).
2.2.4. Phương pháp định lượng vi rút và vi khuẩn (Leruste và cs, 2012; Patel và cs, 2007)
a) Cơ sở và nguyên lý
- Kỹ thuật định lƣợng vi rút (20–200 nm) trực tiếp trên kính hiển vi huỳnh quang (epifluorescence microscopy) đã đƣợc đƣa ra lần đầu tiên bởi Hennes và Suttle (1995), sau đó đƣợc cải tiến bởi Noble và Fuhrman (1998). Và tới nay, quy trình định lƣợng vi rút và vi khuẩn từ mẫu nƣớc (Patel và cộng sự, 2007) và từ mẫu dịch nhầy san hô (Leruste và cộng sự, 2012) đã đƣợc thiết lập dựa trên màng lọc Anodisc có kích thƣớc lỗ 0,02 µm với thuốc nhuộm
SYBR Gold. Thuốc nhuộm này đã đƣợc chứng minh là một chất nhuộm mới có nhiều ƣu điểm và có tính ổn định cao trong định lƣợng vi rút và vi khuẩn từ môi trƣờng nƣớc (Chen và cs, 2001), chúng có khả năng nhuộm với cả DNA và RNA.
- Các phân tử SYBR Gold sẽ bám dính vào các phân tử DNA và RNA trong genome của vi rút và vi khuẩn đã đƣợc cố định trên màng Anodisc. Dƣới ánh sáng kích thích màu xanh (450 – 550 nm) của kính hiển vi huỳnh quang, các hạt vi rút và các tế bào vi khuẩn hiển thị lần lƣợt là các đốm sáng màu vàng-xanh bé và lớn (hình 2.6). b) Nguyên vật liệu Màng Anodisc có kích thƣớc lỗ 0,02 µm, đƣờng kính 25 mm (Whatman) Bộ lọc màng Polycarbonate kích thƣớc lỗ 0,2 µm và 0,8-2,0 mm, đƣờng kính 25 mm (Millipore) Kẹp giữ bộ lọc: cố định các bộ phận lọc đƣờng kính 25 mm và phễu 15 ml (Millipore) Bình chân khơng
Đĩa Petri, pipet man, kẹp màng lọc Lam kính và lamen
Giấy Kimwipes hoặc khăn giấy SYBR Gold, 10,000X (Invitrogen)
Dung dịch đệm từ hỗn hợp của 50% glycerol và 50% đệm TE (TrisCl: 10 mM, EDTA 1 mm, pH 7,4-7,6
Dung dịch đệm 1% kali citrate (10 g Kali citrate; 1,44 g.l-1 Na2HPO4.7H2O và 0,24 g.l-1 KH2PO4)
Bơm tay Nalgene Máy lắc vortex
c) Quy trình thực hiện
100 ml chất nhầy san hô đƣợc cho vào 900 ml dung dịch đệm 1% kali citrate, pH 7, đƣợc lọc qua màng 0,02 µm. Lắc (vortex) ở tốc độ vừa phải trong 5 phút. Sau đó, 200-500 ml dung dịch đƣợc lọc và cố định các hạt vi rút và tế bào vi khuẩn trên màng Anodisc với kích thƣớc lỗ 0,02 µm, rửa với 500 ml đệm TE và nhuộm bởi chất nhuộm huỳnh quang - SYBR Gold (Molecular Probes, Europe, Leiden, Netherlands) nồng độ 2X theo phƣơng pháp của Patel và cộng sự (2007). Theo đó, màng lọc Anodisc đƣợc đặt lên trên giọt dung dịch (40 µl) SYBR Gold 2X và nhuộm trong điều kiện nhiệt độ phòng và tối trong 15 phút. Sau khi nhuộm, dùng kẹp lấy các màng lọc ra và loại bỏ phần dịch còn lại trên màng lọc bằng giấy Kimwipe. Sau đó màng lọc đƣợc làm khơ trên giấy Kimwipe hoặc dƣới ánh sáng đỏ. Màng lọc khô đƣợc đặt úp lên giọt dầu (CITIFLOUR – AF1 – GLYCEROL) trên lamen, sau đó đặt úp cả màng lamen lên lam kính và cố định.
Đối với mẫu nƣớc: 50 ml nƣớc biển đƣợc lọc và cố định trực tiếp trên màng Anodisc. Các bƣớc xử lý tiếp theo tƣơng tự nhƣ đối với mẫu dịch nhầy san hô ở trên.
Số lƣợng vi rút, vi khuẩn và hình thái vi khuẩn (cầu khuẩn, trực khuẩn, phẩy khuẩn và xoắn khuẩn) đƣợc xác định và định lƣợng trực tiếp trên kính hiển vi với độ phóng đại 1000x, mỗi mẫu đƣợc đếm trên 10 hiển vi trƣờng ở khắp các vị trí khác nhau của màng lọc, mỗi hiển vi trƣờng đƣợc đếm trên tồn diện tích của trắc vi thị kính (10 x 10 ơ). Mật độ trung bình của vi rút, vi khuẩn đƣợc tính theo cơng thức:
M = Y x RSF x (100/n)/V.
Trong đó: Y là số lượng trung bình của vi rút hoặc vi khuẩn có trong mỗi trắc vi thị kính (10 x 10 ô); n là số lượng ô được đếm trong mỗi trắc vi thị
kính (có 10 x 10 = 100 ô); RSF là tỉ số diện tích của màng lọc (Anodisc)/diện tích mỗi trắc vi thị kính (10x10 ơ); V là thể tích của mẫu được lọc (ml).
Hình ảnh điển hình minh họa các bƣớc cơ bản của phƣơng pháp đƣợc thể hiện trên Hình 2.5 và Hình 2.6
(1) Vật liệu và dụng cụ chính chính (2) Đặt màng lọc lên phểu lọc
(4) Đặt màng lọc lên trên giọt dung dịch SYBR Gold
(3) Nhỏ 40µl dung dịch SYBR Gold (2x) lên đĩa Petri
(6) Lấy màng ra và loại bỏ thuốc nhuộm cịn dƣ (5) Nhuộm màng trong điều kiện tối 15 phút
Hình 2.5. Hình ảnh biểu thị các bƣớc xử lý chính trong phân tích (nguồn ảnh: http://www.virusecology.org/MOVE/Method%206.html)
Hình 2.6. Sơ đồ các bƣớc định lƣợng vi rút, vi khuẩn trên kính hiển vi huỳnh quang
2.2.5. Phương pháp ni cấy vi khuẩn dị dưỡng và Vibrio
Mẫu đƣợc pha loãng ở 4 độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4; sau đó 50 µl mẫu ở mỗi độ pha loãng đƣợc cấy gạt trên đĩa môi trƣờng thạch, nuôi ở 28°C trong 24-72 giờ. Vi khuẩn dị dƣỡng đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MA
(Marine Agar) theo Hayasaka (Hayasaka và Smith, 1982), nhóm vi khuẩn
Vibrio trên mơi trƣờng TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Salts Sucrose agar)
theo Pfeffer và Oliver (2003). Khuẩn lạc trên đĩa thạch đƣợc đếm bởi mắt thƣờng, kính lúp. Các khuẩn lạc riêng biệt, có các đặc điểm hình thái khác nhau đƣợc cấy sang ống thạch nghiêng của môi trƣờng MA, nuôi tại điều kiện phân lập và bảo quản tại -4°C để sử dụng làm giống cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.6. Phương pháp xác định tỉ lệ tế bào vi khuẩn có hoạt động hơ hấp bằng máy đo dòng tế bào – Flow Cytometry (Marine và cs, 2013)
chúng trong môi trƣờng (Servais và cs, 2001). Khi vi khuẩn có hoạt động hơ hấp, hệ thống vận chuyển electron của chúng sẽ bị gắn thuốc nhuộm CTC (5- cyano-2,3-ditolyltetrazolium chloride) và chúng sẽ phát ánh sáng đỏ ở bƣớc sóng 488 nm (Sherr, 1999). Số lƣợng tế bào có chứa CTC sẽ đƣợc định lƣợng bởi máy đo dịng tế bào (Flow-cytometry).
Quy trình: Các tế bào vi khuẩn chứa CTC sẽ phát màu tại bƣớc sóng kích
thích 488 nm và đƣợc phát hiện dựa vào tia phát sáng ở góc 90o (the 90o light scatter) và ánh sáng lạnh màu đỏ (fluo-rescence - FL3) của CTC qua máy đo dòng Flow-cytometry hiệu FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). Các hạt huỳnh quang (kích thƣớc 1, 2, 6, 10, 20 μm, Polysciences Inc., Warrington, PA) đƣợc bổ sung vào từng mẫu để thiết lập các nhóm hạt chuẩn với kích thƣớc đã biết. Tỷ lệ (%) tế bào có hơ hấp đƣợc tính tốn so với tổng số vi khuẩn thu đƣợc bằng phƣơng pháp nhuộm SYBR Gold trên kính hiển vi huỳnh quang.
2.2.7. Phương pháp đánh giá đa dạng chức năng của vi khuẩn bằng đĩa sinh thái - Biolog Ecoplate (Christian và Lind, 2006)
Nguyên lý của phương pháp: Biolog-Ecoplate (Biolog) là bản microtiter
96 giếng - có chứa 31 loại hợp chất hữu cơ, phân thành 6 nhóm chất (carbohydrates, amino-acids, phenols, carboxylic acids, polymers và amines) đƣợc lặp lại ba lần (Bảng 2.2). Trong đó mỗi giếng có chứa một nguồn cacbon và ngậm chất nhuộm ơxi hóa khử tetrazolium ở dạng khô. Khi vi khuẩn sinh trƣởng và ơxi hóa các hợp chất hữu cơ trong giếng, dinucleotide nicotinamide adenine (NADH) đƣợc tạo thành và chất nhuộm ơxi hóa khử tetrazolium biến thành formazan, lúc đó sẽ xuất hiện màu tím, và lƣợng chất hữu cơ bị chuyển hóa tỉ lệ thuận với độ đậm của mầu tím trong giếng, và cƣờng độ mầu sẽ đƣợc định lƣợng thông qua máy quang phổ. Tổng hợp các
kết quả thay đổi mầu trong các giếng của bản microtiter sẽ góp phần phản ánh sự đa dạng chức năng của quần xã vi khuẩn trong mẫu ban đầu.
Bảng 2.2. Phân nhóm 31 nguồn carbon trên bản Biolog Ecoplate Nhóm chất TN Chất thí nghiệm Ký hiệu Nhóm chất TN Chất thí nghiệm Ký hiệu carb o h y d ra te s β-Methyl-D- Glucoside A2 phenols 2-Hydroxy Benzoic Acid C3 D-Galactonic γ- Lactone A3 4-Hydroxy Benzoic acid D3 D-Xylose B2 carb o x y li c aci d s
Pyruvic Acid Methyl
Ester B1
i-Erythritol C2 D-Galacturonic acid B3 D-Mannitol D2 γ-Hydroxybutyric acid E3
N-Acetyl-
Glucosamine E2 D-glucosaminic acid F2
D-Cellobiose G1 Itaconic Acid F3
Glucose-1-Phosphate G2 α-Ketobutyric acid G3
α-D-Lactose H1 D-Malic Acid H3
D,L-α-Glycerol Phosphate H2 p o ly mer s Tween 40 C1 ami n o -ac id s L-Arginine A4 Tween 80 D1 L-Asparagine B4 α-Cyclodextrin E1 Lphenylalanine C4 Glycogen F1 L-Serine D4 amines Phenylethylamine G4 L-Threonine E4 Putrescine H4
Glycyl-L-glutamic acid F4 H2O H2O A1
Các bước thí nghiệm: Mỗi giếng đƣợc thí nghiệm với 150 μl mẫu và sau
đó đem ni trong điều kiện tối, nhiệt độ 27o
C trong thời gian 9 ngày. Sau mỗi 24 giờ nuôi, mật độ quang của bản Biolog Ecoplate đƣợc xác định bằng máy đọc đĩa Microplate Reader (BIO RAD Model 680) tại bƣớc sóng 590 nm. Các bƣớc thí nghiệm đƣợc thể hiện trên sơ đồ ở Hình 2.7.
Thu mẫu nước biển từ các trạm nghiên vứu
Cho mẫu vào các giếng thí nghiệm (150µl/giếng)
Ni trong điều kiện tối và nhiệt độ
250C
Mật độ quang của các giếng đo bởi máy Microplate reader, tại bước sóng
590nm
Xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng
Kết quả thí nghiệm
Hình 5. Sơ đồ thí nghiệm
Thu mẫu nước biển từ các trạm nghiên vứu
Cho mẫu vào các giếng thí nghiệm (150µl/giếng)
Ni trong điều kiện tối và nhiệt độ
250C
Mật độ quang của các giếng đo bởi máy Microplate reader, tại bước sóng
590nm Xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng Kết quả thí nghiệm Hình 5. Sơ đồ thí nghiệm Thu mẫu từ các trạm nghiên cứu
2.2.8. Phương pháp xác định đa dạng di truyền quần xã vi khuẩn bằng kỹ thuật điện di biến tính (DGGE)
2.2.8.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số (Muyzer và cs, 1993)
Vi khuẩn trong 50 ml mẫu nƣớc hoặc 2 ml mẫu chất nhầy san hơ đƣợc lọc qua màng polycarbonate có kích thƣớc lỗ 0,2 µm, đƣờng kính 47 mm. Các tế bào vi khuẩn đƣợc giữ lại trên màng lọc sẽ đƣợc tách chiết DNA tổng số:
DNA đƣợc tách với 500 µL đệm phân giải có chứa lysozyme (ủ trong 30 phút tại 37°C; nồng độ lysozym là 1 mg mL-1); tiếp theo, dung dịch đƣợc thêm protein K (đạt nồng độ 100 µg mL-1) và đệm SDS (1%), sau đó đƣợc ủ trong thời gian 18 giờ tại nhiệt độ 55°C. Các màng lọc đƣợc rửa với 500ml đệm TE (10 mM Tris-HCl, pH7.5, 1 mM EDTA). Dịch phân giải sau đó đƣợc kết tủa trong isopropanol với tỉ lệ thể tích 0,6 dịch phân giải / 1 isopropanol (thời gian tủa là 1h tại nhiệt độ 20°C), ly tâm 20 phút với tốc độ 13000 vịng/phút, loại bỏ dịch phía trên, rửa với 500 µL cồn 70%, và ly tâm tiếp 20 phút với tốc độ 13000 vịng/phút, loại bỏ dịch nổi phía trên. Chất kết tủa đƣợc hong khô trong chân không hoặc dƣới ánh sáng đèn đỏ. Sau đó DNA tổng số đƣợc hịa tan bằng 100 µL đệm TE, và bảo quản ở -20°C cho tới khi chạy PCR.
2.2.8.2. Phương pháp phản ứng chuỗi trùng hợp (Muyzer và cs, 1993)
Vùng V3 của 16S rDNA đƣợc nhân lên bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi 341F-GC (5’-GC-clamp-CCT ACG GGA GGC AGC AG -3’) và 518R (5’- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’), trong đó, 40 cặp nucleotide ―GC-clamp‖ (CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G) đƣợc gắn vào mồi để tạo thành một vùng có khả năng chịu mức biến tính cao nhất nhằm ngăn chặn sự biến tính hồn tồn của các đoạn DNA (McCammon và cs, 2005), và kít PuRe TaqTM Ready-To-Go PCR beads (GE
chu trình nhiệt nhƣ sau: nhiệt biến tính ban đầu là (94°C trong 5 phút); sau đó là 20 chu kỳ với nhiệt độ biến tính (94°C trong 30 giây), ủ (65-55°C trong 30 giây, giảm xuống 0,5°C một chu kỳ) và tăng lên (72°C trong 1 phút); và 10 chu kỳ chuẩn với nhiệt biến tính (94°C trong 1 phút), ủ tại 55°C trong 30