h. Độ phõn giải và cỏc yếu tố ảnh hưởng (sự tỏch hai chất)
2.2.2. Chọn van bơm mẫu
Từ khi sắc ký lỏng ra đời thỡ phương phỏp bơm mẫu theo kiểu xi lanh khụng cũn phự hợp nữa. Thay vào đú, người ta sử dụng cỏc van bơm mẫu để nạp chớnh xỏc lượng mẫu phõn tớch vào cột tỏch. Để đỏp ứng được yờu cầu bơm thể tớch mẫu chớnh xỏc với sai số rất nhỏ (khoảng 0,05l), người ta sử dụng cỏc vũng mẫu với thể tớch xỏc định. Nguyờn lý cơ bản của hệ bơm mẫu trong sắc ký lỏng là mẫu ban đầu được nạp vào trong vũng mẫu bằng một xi lanh ở ỏp suất thường, sau nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu được dũng pha động nạp vào cột tỏch. Độ chớnh xỏc, độ đỳng và lượng mẫu cần thiết nạp vào cột tỏch sắc ký khụng những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà cũn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào trong cột.
Dựa vào khả năng thay đổi cỏc vũng chứa mẫu khỏc nhau mà cú thể thay đổi thể tớch bơm mẫu vào cột. Một trong những khú khăn của phộp tỏch sắc ký là sự mở rộng chõn pớc, dẫn đến hiện tượng chồng pớc. Trong đú, lượng mẫu được bơm vào cột cũng là một nguyờn nhõn gõy ra hiện tượng này. Nếu vũng mẫu quỏ dài, lượng mẫu bơm vào cột quỏ lớn thỡ hiện tượng doóng pớc càng lớn và cỏc pớc càng chốn lờn nhau.
Ngược lại, nếu thể tớch bơm mẫu là quỏ nhỏ thỡ sai số cũng sẽ rất lớn, vớ dụ nếu sai số của van bơm mẫu là 0,05l, khi bơm thể tớch mẫu là 1l thỡ sai số sẽ là 5%, cũn nếu thể tớch mẫu bơm là 50l thỡ sai số là 0,1%.
hiệu hay chiều cao của pớc sắc ký sẽ tăng theo sự tăng của thể tớch mẫu. Đến một giới hạn Vs ≥ Vo nào đú nếu ta tiếp tục tăng thể tớch mẫu thỡ chiều cao pớc sắc ký cũng khụng tăng nữa mà lỳc đú pớc sắc ký sẽ tự và doóng chõn mà khụng sắc nột nữa. Vỡ vậy việc chọn vũng mẫu cũng rất quan trọng.
Bỡnh thường nếu độ nhạy đủ để phõn tớch thỡ chỳng ta chỉ nờn dựng vũng mẫu càng nhỏ càng tốt để trỏnh doóng pớc và tạo nờn pớc cú độ sắc nột cao. Trong HPLC người ta thường dựng vũng mẫu 20, 50 và 100 àl, trong đú vũng mẫu 20 àl được dựng phổ biến nhất. Trong trường hợp phõn tớch cỏc axớt amin để đạt được hiệu quả tỏch tốt, chỳng tụi đó sử dụng vũng mẫu 20 àl trong suốt quỏ trỡnh tỏch và xỏc định axớt amin.