Chú thích: 1 - chứng dương, 2 - chứng âm, 3 - kết quả mẫu dương tính
1.4.2. h ơng pháp t nghiệm chẩn đoán trực tiếp
L phương ph p tóm bắt trực tiếp tác nhân gây b nh (hay còn gọi là xét nghi m vi r t học) như ph t hi n kháng nguyên virut trong máu (P24), các axit nucleotit của virut: ARN hoặc ADN provirut (tế bào nhiễm) hoặc phân lập virut bằng nuôi cấy tế bào [3].
Phương pháp xét nghi m trực tiếp được dùng để phát hi n nhiễm HIV ở trẻ dưới 18 tháng tuổi [11]. Đối với trẻ em sinh ra từ mẹ nhiễm HIV, kháng thể kháng
HIV của mẹ có thể tồn lưu trong máu trẻ cho đến trước 18 tháng tuổi do đó x t nghi m phát hi n kháng thể dương tính ở trẻ chưa thể kết luận trẻ b nhiễm HIV mà cần thực hi n các xét nghi m virut học. Xét nghi m chẩn đo n nhiễm HIV cho trẻ sinh từ mẹ có huyết thanh dương tính n n được tiến hành từ 4 - 6 tuần sau khi sinh hoặc sau đó c ng sớm càng tốt với các kỹ thuật phát hi n ADN/ARN provirut hoặc kháng nguyên P24 của HIV [120,121]. Kỹ thuật PCR phát hi n HIVADN thường được chỉ đ nh do có độ nhạy, độ đặc hi u cao, có thể sử dụng lấy trên giấy thấm giọt máu khô (DBS) dễ bảo quản và vận chuyển từ những nơi xa ph ng x t nghi m [96]. Trẻ cần được khẳng đ nh sớm tình trạng nhiễm HIV để được điều tr sớm khơng cần chờ có các dấu hi u lâm sàng hoặc suy giảm miễn d ch [13].
C c phương ph p trực tiếp phát hi n tác nhân virut c n được dùng trong các trường hợp chẩn đo n sớm nhiễm HIV ở người lớn trong giai đoạn cửa sổ chưa có sự chuyển đổi huyết thanh hoặc khi xét nghi m bằng phương ph p gi n tiếp tìm kháng thể có kết quả khơng rõ ràng [3, 8].
1.4.2.1. Các k thu t phát hiện kháng nguyên P24 (antigen P24)
Kháng nguyên P24 là protein cấu thành của lõi vi r t, bao bọc các chất li u di truyền và là một chỉ số phản ánh sự nhân lên của vi r t. h ng nguy n P24 tồn tại dưới dạng tự do hoặc trong phức hợp kháng nguyên-kháng thể [45, 56]. Phát hi n kháng nguyên P24 th ng thường được sử dụng trong:
- Chẩn đo n nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh [11]: Đây l một kỹ thuật kém nhạy nhưng rất đặc hi u. Hi n nay, các sinh phẩm phát hi n kháng nguyên P24 đã được hoàn thi n để nâng cao độ nhạy.
- Phát hi n sớm giai đoạn mới nhiễm HIV [3]: Trong giai đoạn đầu mới nhiễm HIV, kháng nguyên P24 có thể được phát hi n trước khi có sự biến đổi huyết thanh, ở giai đoạn cửa sổ khi chưa có kh ng thể.
- Theo dõi diễn tiến nhiễm HIV [14]: Kháng nguyên P24 có thể được phát hi n rất sớm ở giai đoạn mới nhiễm. Cùng với sự xuất hi n kháng thể, nồng độ kháng nguyên P24 tự do trong máu giảm. Ở giai đoạn cuối, cùng với sự giảm kháng thể kháng P24, sự tái xuất hi n v gia tăng nồng độ P24 tự do là một ti n lượng chuyển sang AIDS.
- Theo dõi đ p ứng điều tr với thuốc kh ng vi r t [4,12].
- Phát hi n có sự nhân lên của vi r t trong nu i cấy tế bào.
1.4.2.2. Các k thu t sinh h c phân tử phát hiện ARN hoặc ADN provirut HIV
- Các kỹ thuật PCR và Real Time PCR phát hi n ADN tiền vi r t trong tế bào nhiễm hoặc HIV - ARN trong huyết tương, được áp dụng trong xét nghi m phát hi n sớm nhiễm HIV [63, 11]; đo tải lượng vi r t trong theo dõi điều tr [4, 7].
- Các nguyên tắc của các kỹ thuật sinh học phân tử HIV: Phản ứng PCR là kỹ thuật cho phép khuếch đại một lượng rất nhỏ phân tử ADN đích được tách chiết từ các tế bào nhiễm hoặc được tổng hợp từ các ARN của vi r t nhờ enzym sao chép ngược RT (ADNc) [96]; kỹ thuật Real time PCR - cho phép khuếch đại v x c đ nh số lượng các chuỗi ADN được tạo ra trong từng chu kỳ nhi t [3].
Các sinh phẩm dùng trong xét nghi m HIV phải có độ nhạy tối thiểu > 99,5% với các sinh phẩm xét nghi m nhanh, 100% với các kỹ thuật ELISA/hóa phát quang đi n hóa phát quang và độ đặc hi u tối thiểu > 98%. Các tiêu chuẩn này cần dựa theo các đ nh giá tiêu chuẩn của WHO, CDC Hoa kỳ hoặc đ nh giá của Quốc gia và các tổ chức có uy tín khác [8].
1.5. Các kỹ thuật xét nghiệm xá định tỷ lệ mới nhiễm HIV
Từ năm 2008, WHO UNAID đã th nh lập một nhóm chuyên gia kỹ thuật để phát triển c c hướng dẫn quốc gia, đ nh gi và sử dụng các xét nghi m phát hi n mới nhiễm HIV. Đến năm 2017, t m kỹ thuật xét nghi m mới nhiễm HIV đã được sử dụng trên thế giới (bảng 1.1). Một vài kỹ thuật phát triển đặc bi t với mục đích x c đ nh tỷ l mới nhiễm trong quần thể, trong khi một số kỹ thuật kh c được thương mại hóa sử dụng cho mục đích chẩn đo n [119]. Với một số ít các kỹ thuật được chấp nhận trong xét nghi m HIV, hầu hết các kỹ thuật được li t kê ở bảng 1.1 đều chưa được đ nh gi phù hợp để đạt được các giá tr chính xác của giá tr trung bình thời gian mới nhiễm và tỷ l phân loại sai trong các phân nhóm HIV-1 [73,88,108].
Bảng 1.1. Tổng hợp tám kỹ thuật phát hiện mới nhiễm HIV đ n sử dụng trên thế giới
Kỹ thuật xét nghiệm Loại hình xét nghiệm Hạn chế của sinh phẩm Đã đƣợ t ƣơn mại hóa (nếu có)
K thu t miễn dịch gắn enzym kém nhạy, sinh phẩm gồm:
-Avoid HIV-1
-Ora Quick Advance Rapid HIV- 1/2 assay
Đ nh lượng - Hạn chế sử dụng trong các quần thể, ưu ti n HIV -1 phân nhóm B,
- Kỹ thuật yêu cầu tách riêng mẫu hi u chuẩn (calibrator) cho từng phân nhóm riêng bi t. Điều n y đã dẫn đến vi c sẽ có các thơng số RITA khác nhau cho từng phân nhóm.
- PLS là mới nhiễm với: những người nhiễm HIV lâu có miễn d ch tốt và những người đang điều tr ARV.
Aviod [68]
K thu t đo tỷ lệ, sinh phẩm gồm:
BED-CEIA
Tỷ l PLS là mới nhiễm với: những người nhiễm HIV
lâu có miễn d ch tốt và những người đang điều tr ARV.
- Sedia BioCences Corporration
- Caplypte Biomedical Corporration [91]
K thu t ái lực, sinh phẩm gồm: - Anti-HIV 1+2
- AxSYM HIV-1/2 gO,
- Avidity Index và LAg-Avidity EIA,
- Biorad HIV1/2+O Avidity EIA
Ái lực PLS là mới nhiễm với: những người nhiễm HIV
lâu có miễn d ch tốt và những người đang điều tr ARV.
- Ortho Clinical Diagnostic [37],
- Abbott [105, 106],
- Kỹ thuật nội bộ [117],
Kỹ thuật xét nghiệm Loại hình xét nghiệm Hạn chế của sinh phẩm Đã đƣợ t ƣơn mại hóa (nếu có)
K thu t ưu thế miễn dịch, sinh phẩm gồm: IDE-V3
Miễn d ch trội Kỹ thuật có độ nhạy thấp. Kỹ thuật nội bộ [24]
K thu t phát hiện kháng nguyên P24
Phát hi n trực tiếp kháng nguyên p24
- P24 dương tính c n kh ng thể kháng HIV âm tính (1-2 tuần),
- Yêu cầu một số lượng mẫu lớn trong quần thể để đạt l m được c c ước tính mới nhiễm.
K thu t phát hiện ARN HIV Phát hi n trực tiếp ARN
Yêu cầu một số lượng mẫu lớn trong quần thể để đạt l m được c c ước tính mới nhiễm.
COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitavie test v2.0 – Roche [96] K thu t phát hiện kháng thể kháng P24 IgG3, sinh phẩm gồm: Anti-p24 IgG3 Phản ứng với kháng thể kháng P24
Các kết quả t m ra chưa được đ nh gi tr n c c quần thể nhiễm HIV khác nhau với các phân nhóm khác nhau.
Kỹ thuật nội bộ [125]
K thu t miễn dịch dòng, sinh phẩm gồm: INNO-LIA HIVI/II
Score
Kỹ thuật miễn d ch dịng
Kỹ thuật này có chi phí cao, chỉ nên sử dụng trong xét nghi m khẳng đ nh thường quy.
1.5.1. Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym kém nhạy (Less-sensitive enzym immunoassay)
Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý miễn d ch gắn enzym (EIA) đã thay đổi một chút cho phù hợp với các xét nghi m phát hi n sớm nhiễm HIV: x c đ nh được nồng độ kháng thể tăng dần trong một khoảng thời gian [68].
Các mẫu đã được khẳng đ nh nhiễm HIV sẽ được pha loãng 1/20 000 và giảm thời gian ủ mẫu trong quá trình xét nghi m lại bằng kỹ thuật miễn d ch gắn enzym kém nhạy. Những người mới nhiễm HIV v đ p ứng miễn d ch sớm sẽ có nồng độ kháng thể thấp vì vậy sẽ cho kết quả âm tính trong xét nghi m miễn d ch gắn enzym kém nhạy này [65].
Hai kỹ thuật xét nghi m miễn d ch gắn enzym kém nhạy đã ph t triển thành sinh phẩm thương mại tr n thi trường (Abbott 3A11 và Avioq HIV-1) [68]. Tuy nhiên sinh phẩm Abbott 3A11 hi n nay đã ngừng sản xuất. Các sinh phẩm xét nghi m nhanh đang được phát triển thay thế dần cho các xét nghi m EIA [69]. Hạn chế của các sinh phẩm là chỉ phù hợp với phân nhóm B của HIV-1, mặt khác giá tr trung bình về thời gian mới nhiễm HIV cho kết quả khác nhau với các phân nhóm khác nhau vì vậy khơng được ứng dụng rộng rãi trên thế giới [114].
1.5.2. Các kỹ thuật ác định tỷ lệ kháng thể IgG
Các kỹ thuật này được ứng dụng để x c đ nh tỷ l kháng thể IgG kháng HIV trên toàn bộ kháng thể IgG có trong huyết thanh/huyết tương. Kháng thể IgG kháng HIV ở người mới nhiễm sẽ thấp hơn so với người đã nhiễm lâu. Sinh phẩm BED-CEIA được phát triển dựa trên nguyên lý này: sử dụng một peptide phân nhánh, gồm các trình tự đặc hi u trên gp41 của ba phân nhóm B, E v D; đoạn peptide chung cho nhiều phân nhóm n y sau đó được dùng để đo tỷ l đang tăng l n của kháng thể IgG đặc hi u HIV so với IgG toàn phần sau giai đoạn chuyển đổi huyết thanh. Sinh phẩm BED được ứng dụng để ước tính tỷ l mới nhiễm trong quần thể [91].
1.5.3. Các kỹ thuật ái lực
Ái lực có li n quan đến sức mạnh liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hi u HIV. Các kỹ thuật ái lực dựa trên giả thuyết rằng các kháng thể có ái lực thấp sẽ được nhận đ nh là mới nhiễm gần đây. Theo c ch đo tổng số kháng thể kháng
HIV, một tác nhân biến tính được th m v o để tách các kháng thể có ái lực yếu ra ngồi. Chỉ số ái lực sau đó sẽ được tính [37, 77,106, 117]
1.5.4. Kỹ thuật IDE- 3 ( u thế miễn dịch)
Kỹ thuật IDE-V3 dựa trên hai trình tự miễn d ch di truyền học bảo thủ tìm thấy ở phần bao ngồi (envelop) của HIV-1. Trình tự thứ nhất là vùng quyết đ nh kháng nguyên (IDE) gp41 bao gồm 2 oligopeptide loại 30 amino acid; còn một từ nhóm M và phân nhóm D. Trình tự thứ hai là từ mạch vòng V3 của gp120 bao gồm 5 oligopeptide từ các phân nhóm A, B, C, D và E. Kỹ thuật này sử dụng công thức tốn học để tính nồng độ kháng thể liên kết với kháng nguyên từ mỗi vùng để phân bi t người mới nhiễm HIV [24].
1.5.5. Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên p24
Kỹ thuật n y thường sử dụng để phát hi n nhiễm HIV sau vài ngày có nguy lây nhiễm trước khi xuất hi n kháng thể. Mức độ kháng nguyên p24 sẽ giảm dần thì h thống miễn d ch của cơ thể tăng l n. Ph t hi n được kháng nguyên p24 trong thời gian đầu khi cơ thể chưa sinh ra kh ng thể cũng được xem như l một xét nghi m phát hi n sớm mới nhiễm HIV. Tuy nhiên p24 chỉ xuất hi n nhiều trong khoảng 1-2 tuần đầu tiên sau khi lây nhiễm, sau đó mất dần thay v o đó l sự tăng lên của các kháng thể IgG, chính vì vậy các xét nghi m khó có thể phát hi n trong thời gian này [125].
1.5.6. Kỹ thuật phát hiện ARN HIV
Kỹ thuật n y thường sử dụng để phát hi n nhiễm ARN có trong huyết tương người khi chưa xuất hi n kháng thể v được sử dụng như một sinh phẩm phát hi n sớm mới nhiễm HIV. ARN có thể phát hi n sớm hơn cả kháng nguyên p24, thời gian tồn tại ARN k o d i hơn p24 nên có thể dùng trong phát hi n sớm mới nhiễm HIV. Th m v o đó x t nghi m có thể dùng cách trộn các mẫu (pool) l m tăng độ chính xác trong kỹ thuật khuyếch đại ARN và giảm giá thành sản phẩm. Tuy nhiên để sử dụng phát hi n mới nhiễm HIV đ i hỏi c mẫu rất lớn, khó triển khai trong quần thể [125].
1.5.7. Kỹ thuật phát hiện kháng thể IgG 3 kháng p24 (IgG3 anti-p24)
Dạng IgG 3 thường xuất hi n trong thời gian đầu mới nhiễm HIV, là kháng thể kháng lại p24. Sử dụng kỹ thuật miễn d ch gắn enzym (EIA) để phát hi n IgG 3 trong vòng 1-4 th ng đầu mới nhiễm HIV. Các kết quả từ những nghiên cứu đầu ti n chưa được sử dụng cho các quần thể khác với các phân nhóm khác nhau [125].
1.5.8. Kỹ thuật miễn dịch dòng
Kỹ thuật miễn d ch d ng tương tự như kỹ thuật Western Blot nhưng sử dụng khoảng giới hạn oligopeptide tổng hợp và các kháng nguyên tái tổ hợp của cả HIV- 1 và HIV-2. Th ng thường kỹ thuật sẽ được sử dụng như một xét nghi m khẳng đ nh cuối cùng để x c đ nh sự có mặt của kháng thể kháng HIV. Sinh phẩm INNO- LIA HIVI/II Score- hãng Innogenetic được sử dụng để xét nghi m xem một người
hoặc là mới nhiễm hoặc không phải là mới nhiễm HIV [98]. Kỹ thuật này có chi phí cao nên sử dụng cho mục đích khẳng đ nh cuối cùng với HIV.
Ở Việt Nam, các kỹ thuật phát hi n P24, ARN/ADN, Western Blot được sử
dụng là xét nghi m thường quy trong chẩn đo n v phát hi n tỷ l hi n nhiễm, chưa có một nghiên cứu nào sử dụng các sinh phẩm này để ước tính tỷ l mới nhiễm do giá thành cao và c mẫu cần quá lớn.
Đến năm 2010, sinh phẩm BED và LAg-Avidity mới chính thức đưa v o nghiên cứu ở Vi t Nam với quy mô lớn [123].
- Sinh phẩm miễn dịch gắn enzym tóm bắt B,E,D (BED-CEIA)
Dùng để đo tỷ l của kháng thể đặc hi u IgG với tổng số kháng thể IgG có trong huyết thanh, huyết tương hoặc trên mẫu giọt máu khô DBS, mẫu giọt huyết tương kh DPS để xác đ nh được tỷ l mới nhiễm HIV trong một quần thể [102]. Sinh phẩm n y được sử dụng phục vụ chủ yếu trong các nghiên cứu giám sát d ch tễ học HIV [36, 102].
Sinh phẩm BED được thiết kế dựa vào nguyên lý miễn d ch gắn enzym để đo được các mức độ tiến triển của kháng thể kháng HIV theo thời gian kể từ sau khi chuyển đổi huyết thanh (hình 1.13). Sử dụng một peptide phân nhánh, gồm các trình tự đặc hi u trên gp41 của ba phân nhóm B, E và D. Đoạn
peptide chung cho nhiều phân nhóm này sau đó được dùng để đo tỷ l đang tăng lên của kháng thể IgG đặc hi u HIV so với IgG toàn phần sau giai đoạn chuyển đổi huyết thanh [111]. Ngư ng cut-off được ghi nhận l 1,0; độ nhạy l 89,1%; độ đặc hi u l 89,1%; độ chính x c để ước tính mới nhiễm là 93% [91].
Sinh phẩm BED sau khi được thẩm đ nh ở CDC Atlanta (Mỹ) đã tiếp tục được triển khai để hoàn thi n sinh phẩm [48, 65, 89-91, 92, 94]. Hạn chế của sinh phẩm BED là ước lượng cao tỉ l mới nhiễm HIV‐1 do phân loại sai một số các trường hợp nhiễm lâu (đã nhiễm hơn 1 năm) thành mới nhiễm trong các nghiên cứu cắt ngang [109].
Sinh phẩm BED chỉ mới được thẩm đ nh và tính tốn tỷ l phân loại sai PLS với một số quần thể tại Châu Phi, Châu Âu và Mỹ, do đó vẫn chưa khẳng đ nh có thể áp những tỷ l này cho các khu vực khác ở Châu Á hay khơng [94].
Hình 1.13. N uy n l s n p ẩm BED [111]