Kỹ thuật xét nghi m phát hi n mới nhiễm HIV-1 BED, LAg-Avidity là xét nghi m miễn d ch gắn enzyme. Kỹ thuật này phát hi n những mẫu chuyển đổi huyết thanh gần đây bằng c ch đo tỷ l kháng thể IgG có trong mẫu huyết thanh hoặc huyết tương tr n tổng số kháng thể IgG. Ngư ng cut-off dựa vào mẫu hi u chuẩn (Calibrator) để x c đ nh tình trạng chuyển đổi huyết thanh gần đây. Mẫu hi u chuẩn cũng được sử dụng để tiêu chuẩn hóa các kết quả hạn chế sự thay đổi. Đây l kỹ thuật đ nh lượng kháng thể. Vì vậy, quy trình kỹ thuật phải tuân thủ chặt chẽ về các kết quả độ chính x c, độ chụm v độ tái lặp: trong quá trình làm xét nghi m BED và LAg-Avidity các mẫu chứng âm (NC), chứng dương thấp (LP), chứng dương cao (HP) và mẫu chuẩn calibrator (CAL) lu n được theo dõi theo nguyên tắc Westgard [52] trong từng lần chạy để đảm bảo các mẫu chứng đều nằm trong ngư ng cho ph p theo hướng dẫn của từng xét nghi m.
1.6. Ƣớc tính tỷ lệ mới nhiễm HIV trên thế giới
Hơn hai thập kỷ qua kể từ b o c o đầu ti n năm 1998 đề cập đến vi c phân bi t c c trường hợp mới nhiễm HIV với c c trường hợp nhiễm lâu [65], cho đến nay các nhóm chuyên gia kỹ thuật vẫn tiếp tục nghiên cứu cải tiến chất lượng các xét nghi m phát hi n mới nhiễm HIV dựa trên nguyên lý đo được các mức độ đ p ứng miễn d ch tăng dần theo thời gian đối với giai đoạn nhiễm gần đây [83].
Huyết thanh/ huyết tương HIV+
Giếng phủ rIDR-M
Dung d ch đ m
Kỹ thuật xét nghiệm ái lực kháng nguyên LAg - Avidity
Kháng thể mạnh Kháng thể yếu Hòa tan kháng thể Cộng hợp Cơ chất TMB Dừng phản ứng và đọc phản ứng
Mặc dù độ chính xác của các xét nghi m mới nhiễm còn gặp nhiều tranh luận, chúng vẫn được ứng dụng rộng rãi trong một số mục đích kh c nhau [22, 25, 60]:
- Đối với cá thể, xét nghi m được sử dụng trong chẩn đo n lâm s ng nhằm đưa b nh nhân v o điều tr sớm.
- Đối với lĩnh vực y tế công cộng, xét nghi m được sử dụng để ước tính tỷ l mới nhiễm HIV trong nhóm người b nh đã được chẩn đo n nhiễm HIV gần đây và trong giám sát các ca b nh. Mục đích quan trọng nhất là sử dụng xét nghi m này để ước tính tỷ l mới nhiễm HIV trong cộng đồng [114].
1.6.1. Các ứng dụng của ớc tính tỷ lệ mới nhiễm HIV
Tỷ l mới nhiễm là một chỉ số đo lường mức độ lan truyền HIV trong cộng đồng. Ước tính tỷ l mới nhiễm được ứng dụng trong c c trường hợp sau [114]:
- Giám sát quần thể những người nhiễm HIV.
- Đ nh gi ảnh hưởng của c c t c động can thi p phòng chống HIV.
- Lựa chọn quần thể để đưa v o thử nghi m lâm sàng, theo dõi tính hi u quả đối với vi c can thi p sớm hoặc điều tr sớm.
1.6.2. Các ph ơng pháp ớc tính tỷ lệ mới nhiễm
Mặc dù tỷ l mới nhiễm l một chỉ số quan trọng nhưng hầu hết c c chương tr nh ph ng chống v h thống gi m s t tập trung v o x c đ nh tỷ l hi n nhiễm hơn l tỷ l mới nhiễm [113]. X c đ nh tỷ l mới nhiễm HIV trong các nhóm quần thể nguy cơ cao lây nhiễm HIV l điểm mấu chốt để ngăn chặn sự lan truyền của đại d ch này [116, 124].
Phương pháp xác định trực tiếp
Là phương ph p sử dụng các xét nghi m sớm mới nhiễm HIV để tính được tỷ
l mới nhiễm trong quần thể.
Chỉ có nghiên cứu thuần tập tương lai theo dõi những người khỏe mạnh đến khi có huyết thanh chuyển đổi nhiễm HIV là tiêu chuẩn v ng để ước tính tỷ l mới nhiễm HIV, nhưng nghi n cứu này lại rất mất thời gian, phức tạp v đắt tiền [39]. Để khắc phục điểm này, các phịng thí nghi m đã ph t triển các sinh phẩm x c đ nh tỷ l mới
nhiễm dựa vào các dấu ấn miễn d ch sinh học về tiến triển của nhiễm HIV trong các quần thể trong các nghiên cứu cắt ngang [102, 103].
Theo tài li u của WHO để ứng dụng phương ph p x t nghi m tỷ l mới nhiễm RITA trong c c điều tra cần chú ý những điểm sau: phải thiết lập sẵn giá trị trung
bình thời gian mới nhiễm theo RITA cho nhóm quần thể điều tra, phải có sẵn giá tr
về tỷ lệ phân loại sai đối với nhóm quần thể điều tra.
Phương ph p ước tính tỷ l mới nhiễm sử dụng một kỹ thuật (hình 1.15) [114,115].
Hìn 1.15. Sơ đồ xét nghiệm mới nhiễm HIV sử dụng một kỹ thuật [115]
*Giá trị trung bình thời gian mới nhiễm theo RITA đã được thiết l p sẵn
Khẳng đ nh nhiễm mới HIV theo thông số RITA
Xét nghi m nhiễm mới
HIV *
C c trường hợp đã khẳng đ nh HIV
Đã nhiễm HIV lâu
Phương ph p ước tính tỷ l mới nhiễm sử dụng kết hợp hai hoặc nhiều kỹ thuật xét nghi m mới nhiễm (hình 1.16) [115].
Hìn 1.16. Sơ đồ ƣớc tính tỷ lệ mới nhiễm sử dụng kết hợp hai hoặc nhiều kỹ thuật xét nghiệm mới nhiễm [115]
CD4 ≥ 200 tế bào/mm³ Âm tính C c trường hợp đã khẳng đ nh HIV Xét nghi m mới nhiễm HIV (1) Xét nghi m mới nhiễm HIV (2) Nhiễm lâu Kết hợp Xét nghi m đếm CD4 Mới nhiễm Nhiễm lâu CD4< 200 tế bào/mm³ Xét nghi m kháng thuốc Dương tính Nhiễm lâu
CD4 ≥ 200 tế bào/mm³ C c trường hợp đã khẳng đ nh HIV XN mới nhiễm HIV* Tiền sử nhiễm HIV XN CD4 Nhiễm AIDS XN kháng thuốc Nhiễm lâu Nhiễm lâu Nhiễm mới Nhiễm > 1 năm Nhiễm lâu
Nhiễm được 1 năm hoặc chưa được chẩn đo n HIV CD4 < 200 tế bào/mm³ Nhiễm lâu Chẩn đo n mắc AIDS Nhiễm lâu Dương tính Nhiễm lâu Âm tính
Khẳng đ nh mới nhiễm HIV dựa vào RITA
Phương ph p ước tính tỷ l mới nhiễm kết hợp với dấu hi u lâm sàng và các xét nghi m khác hoặc thông tin tiền sử của b nh nhân (hình 1.17) [115]
Cơng thức tính tỷ lệ mới nhiễm được sử dụng là [64, 84, 128].
Khơng mắc AIDS
- Cơng thức tính tốn tỷ l phân loại sai (PLS) [124] Số lượng mẫu được xét nghi m bằng sinh phẩm
BED/LAg-Avidity cho kết quả là mới nhiễm HIV
PLS = x 100 Tổng số mẫu được xét nghi m
95% khoảng tin cậy (CI) của PLS = PLS ± 1.96 x √(P x (1‐P))/N trong đó PLS: tỷ l phân loại sai, P: mẫu dương tính, N: mẫu âm tính.
- Cơng thức tính tỷ l mới nhiễm hi u chỉnh [64, 84, 124]:
Ir : tỷ l mới nhiễm HIV
N : số những trường hợp HIV âm tính trong cuộc điều tra P : số những trường hợp HIV dương tính trong cuộc điều tra R : số mẫu được phân loại là mới nhiễm HIV gần đây
ω : số ngày trung bình thời gian mới nhiễm HIV gần đây ε : tỷ l phân loại sai
- Tính c mẫu bằng phần mềm SACEMA, phân tích số li u bằng Epi-Info/SAS. Phương pháp xác định gián tiếp phương pháp truyền thống trong dịch tễ h c)
L phương ph p sử dụng số li u trong giám sát d ch tễ học để ước tính tỷ l mới nhiễm HIV. Các mơ hình tốn h c EPP/SPECTRUM, mơ hình d ch tễ Châu Á (AEM), phương ph p thuần tập tổng hợp… đã được sử dụng để ước tính tỷ l mới nhiễm trong giám sát trọng điểm h ng năm [12]. Các mơ hình này là dễ tính tốn và kh ng đắt tiền. Tuy nhiên những số li u cứu cần có chất lượng cao, tính theo đặc thù từng năm (tỷ l hi n nhiễm, số lượng trong quần thể, tỷ l mắc STI, các hành vi nguy cơ lây nhiễm HIV, tỷ l lây truyền từ mẹ sang con, số lượng điều tr ARV, tỷ l chết do AIDS...). Thường thì tỷ l chết khơng có sẵn hoặc số li u khơng tin cậy; khoảng cách giữa các cuộc điều tra không theo ý muốn.
Đối với d ch tễ học, có thể sử dụng c c suy đo n mới nhiễm từ tỷ l hi n nhiễm HIV và số li u tỷ l người chết cũng như th ng tin đầy đủ của những người nhiễm HIV di biến động. M h nh n y đã được áp dụng rộng rãi, đặc bi t c c nước
đang thực hi n điều tra huyết thanh học thường quy đối với các bà mẹ mang thai được kh m lâm s ng trước sinh (ANC) đến các dự án quốc gia ước tính tỷ l mới nhiễm trong cộng đồng [32, 104].
Mơ hình ước tính tỷ lệ mới nhiễm sử dụng số liệu từ giám sát hành vi nguy cơ cao và lan truyền HIV trong quần thể: phụ thuộc v o th ng tin đầy đủ, đảm bảo
chất lượng trong nhóm h nh vi nguy cơ cao, tỷ l hi n nhiễm cũng như tỷ l lan truyền [83, 110].
Nhằm hướng đến mục ti u kết th c AIDS v o năm 2030, Vi t Nam đang tập trung can thi p v o quần thể có h nh vi nguy cơ cao theo hướng chăm sóc li n tục từ tiếp cận - x t nghi m - điều tr - duy tr điều tr với mục ti u chẩn đo n sớm để điều tr sớm th ng qua phương ph p tiếp cận cộng đồng [4].
Theo thống kê của WHO/UNAIDS đến 2015, có một số nước nghiên cứu về tỷ
l mới nhiễm HIV trong đó có Vi t Nam (bảng 1.2).
Bảng 1.2: Các nghiên cứu tỷ lệ mới nhiễm HIV trên thế giới [114, 121]
Loại Quốc gia Số lƣợng mẫu Phân nhóm
AIDS Bờ biển Ngà,
Mỹ, Thái Lan 488 CRF_AG, B, AE
Thời gian nhiễm > 1 năm Châu Phi 953 CRF_AG, others Thời gian nhiễm > 1 năm Vi t Nam 1.820 AE
Thời gian nhiễm > 1 năm Trung Quốc 479 C
Tổng cộng 3.740 CRF_AG, B, C, AE
Do c c phương ph p ph ng x t nghi m để ước tính tỷ l mới nhiễm cịn có nhiều hạn chế trong: cách thực hi n trong các phân nhóm khác nhau hoặc trong quần thể nên vi c phát triển một phương ph p mới là rất cần thiết. Để khắc phục điều này năm 2010, nhóm chuy n gia CDC Atlanta đã ph t triển sinh phẩm mới có tên là sinh phẩm miễn d ch gắn enzym ái lực kháng nguyên giới hạn LAg-Avidity. Vi t Nam l nước đầu tiên trên thế giới thử nghi m sinh phẩm n y để ước tính tỷ l phân loại sai mới nhiễm HIV và kết quả n y được WHO/UNAID công bố trong Hội thảo quốc tế để c c nước được biết và tiếp tục phát triển để ứng dụng trong giám sát d ch tễ học.
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Theo hướng dẫn của WHO/UNAIDS, muốn t m được tỷ l mới nhiễm HIV của các sinh phẩm thì phải tính được tỷ l phân loại sai. Vì vậy luận án đã tiến hành hai nghiên cứu: nghiên cứu thứ nhất tìm tỷ l phân loại sai cho hai loại sinh phẩm BED- CEIA và LAg-Avidity, nghiên cứu thứ hai là sử dụng tỷ l phân loại sai đã t m được ở nghiên cứu thứ nhất để tính tỷ l mới nhiễm HIV.
2.1. Xá định và so sánh tỷ lệ phân loạ s tron ƣớc tính tỷ lệ mới nhiễm HIV của hai kỹ thuật BED –CEIA và LAg- Avidity trên những bệnh nhân bắt đầu đăn k đ ều trị ARV tại các phòng khám ngoại trú của bốn tỉn tron năm 2010 -2011.
2.1.1. Đối t ợng nghiên cứu
Những người thỏa mãn điều kiện sau đ ề u có thể tham gia vào nghiên cứu: chưa
từng điều tr thuốc kháng virut ART, đã nhiễm HIV hơn 12 tháng, ít nhất 18 tuổi tại thời điểm tham gia.
Những người có bất cứ tiêu chuẩn nào sau đây bị loại ra khỏi nghiên cứu: đã
từng sử dụng thuốc kháng virut, chưa đủ 18 tuổi hoặc, không biết thời gian nhiễm HIV hoặc nhiễm dưới 12 tháng.
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được triển khai tại các phòng khám ngoại trú (PKNT) tại Hà Nội (PKNT huy n Đ ng Anh, huy n Từ Liêm, huy n Gia Lâm), Hải Phòng (PKNT B nh vi n Vi t Ti p, quận Lê Chân), Quảng Ninh (B nh vi n Đa khoa tỉnh, b nh vi n Đa khoa Vân Đồn, b nh vi n th xã Cẩm Phả), và TP Hồ Chí Minh (PKNT quận 1, quận 2, quận 6, quận 10 và quận Tân Đ nh).
Thời gian nghiên cứu: 2010 -2011.
2.1.3. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu
C mẫu của nghiên cứu được tính theo cơng thức [115]
n = Z
2
x pq e2
Giả đ nh các tham số của sinh phẩm LAg-Avidity cũng giống như c c tham số đã được công bố của sinh phẩm BED. Giả đ nh của thử nghi m là p = 5% [114] được đo lường với độ chính xác e =1%, và tỷ l từ chối tham gia là 5% cỡ mẫu
cần thiết cho nghiên cứu này khoảng 1900 mẫu. Thực tế nghiên cứu này thu thập
tổng số 1927 mẫu.
2.1.4. Thiết bị và sinh phẩm, hóa chất đ ợc sử dụng trong nghiên cứu
- Máy rửa phiến, LS12 (Pháp), - M y đọc BioRad E680 (Nhật),
- Máy ủ 250C và 370C LPS – BioRad (Nhật), - Phần mềm exel,
- Máy lắc DTU-2B; Vortex Genius3 IKA (Nhật), - Máy ly tâm nhỏ Eppendorf 5415C và Wealtec,
- H thống máy xét nghi m Real-Time PCR tự động: Roche CAP/CTM, Abbott Real Time m2000,
- H thống máy tách chiết NucliSENS® miniMAG™, - Máy Real-Time bán tự động ABI 7500,
- H thống máy chạy giải trình tự gen sequencing ABI 3130/3500, - H thống AB Sciex API 3200 QTRAP LC/MS/MS đi kèm Shimadzu LC-20A - Sinh phẩm phát hi n sớm Sedia™ BED HIV-1 Incidence EIA (Mỹ), - Sinh phẩm phát hi n sớm Sedia™ HIV-1 LAg-Avidity EIA (Mỹ), - Sinh phẩm xét nghi m đo tải lượng Abbott RealTime HIV-1 (Mỹ),
- Sinh phẩm xét nghi m đo tải lượng Roche COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1 V2.0 (Mỹ)
- Hóa chất xét nghi m các thành phần thuốc kháng virut HIV ARV: HPLC- MS/MS (Mỹ),
- Hóa chất xét nghi m giải trình tự gen nội bộ (in-house) do CDC Atlanta (Mỹ) thiết kế [130],
2.1.5. h ơng pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang, phân tích tìm tỷ l phân loại sai theo hình 2.1.
Các thông tin thu th p: thực hi n theo phụ lục (1- 9).
- Thông tin chung của b nh nhân (tuổi, giới tính), - Thời gian nhiễm HIV của b nh nhân,
- Đường lây nhiễm HIV (tình dục, tiêm chích, mẹ sang con..) - Tiểu sử điều tr ART của b nh nhân,
- Các b nh hi n đang mắc (lao, viêm phổi do nhiễm trùng bào tử…), - Các xét nghi m đã làm và kết quả (CD4, đo tải lượng HIV),
Cơng thức tính tốn và phần mềm phân tích tỷ lệ phân loại sai [115]
Cơng thức tính tốn tỷ l phân loại sai:
Số lượng bệnh phẩm được xét nghiệm bằng sinh phẩm xác định tỷ lệ mới nhiễm cho kết quả là mới nhiễm
PLS = x 100
Tổng số bệnh phẩm được xét nghiệm
95% khoảng tin cậy (CI) của PLS = PLS ± 1.96 x √(P x (1‐P))/N Trong đó:
PLS : Tỷ l phân loại sai mới nhiễm P : Số người dương tính với HIV N : Số người âm tính với HIV
Các số li u được nhập li u hai lần bằng chương tr nh EpiData. Số li u được phân tích bằng phần mềm STATA phiên bản 10.0 và SAS phiên bản 9.2.
X c đ nh và so sá nh tỷ l phâ n lo ại sa i tr ên qu ần th ể nh ững ngư ời b ắt đầ u đăng ký tha m gia đi ều tr t ại các ph òn g khá m ng o ại trú. Thu thập 1927 mẫu từ các phòng khám ngoại trú
Làm xét nghi m BED, LAg-Avidity Nhiễm lâu
XN sàng lọc:
ODn> 2,0 với LAg; ODn> 1,2 với BED XN khẳng đ nh:
ODn>1,0 với LAg; ODn>0,8 với BED XN khẳng đ nh:
ODn ≤1,0 với LAg; ODn≤ 0,8 với BED;
Western Blot để khẳng đ nh lại mẫu l dương tính HIV thực. Nhiễm sớm
XN kiểu gen: tìm phân nhóm, trùng lặp mẫu; xét nghi m ARV; xét nghi m đo tải lượng
-Loại trừ các mẫu trùng, mẫu đã điều tr