Quy tr nh n y được thực hi n theo hình 2.2
Tại phịng phỏng vấn
Đối tượng tham gia đối với nghiên cứu được phỏng vấn theo mẫu các phiếu được cung cấp (Phụ lục 2,3,4,5).
- Tiếp đón người tham gia nghiên cứu. - Xác nhận đồng ý tham gia.
- Thu thập số li u về nhân khẩu.
- Thu thập số li u xét nghi m, sử dụng số li u xét nghi m gần nhất và số li u có sẵn. kiểm tra lại các thông tin.
- PKNT tại TP Hồ Chí Minh gửi các phiếu thu thập số li u của PKNT cho Vi n Pasteur Tp HCM. PKNT tại Hà Nội, Hải Phòng và Quảng Ninh gửi các phiếu thu thập số li u của PKNT cho Khoa HIV/AIDS – Vi n VTDTTƯ h ng th ng.
- Tiếp đón người tham gia nghiên cứu
- Xác nhận đồng ý tham gia bằng lấy chữ ký của người tham gia Tuyển chọn b nh nhân dựa trên các thông tin hồi cứu trên hồ sơ
- Điền các thông tin của b nh nhân vào bộ câu hỏi có mã in sẵn - B nh nhân mang mã nghiên cứu sang phòng xét nghi m lấy máu.
- Lấy 5ml máu vào ống EDTA, ly tâm 2000 vòng/phút trong 10 phút, chắt huyết tương v o 2 ống nghi m (0,5 ml/ống),
- Mẫu huyết tương lưu ở tủ lạnh 2- 80C và được chuyển tới phịng thí nghi m HIV Vi n VSDTTƯ và Vi n Pasteur Hồ Chí Minh (khi đủ 10 mẫu hoặc hai lần một tuần),
- Tại Vi n VSDTTƯ mẫu được lưu ở tủ âm (-20 oC) cho đến khi xét nghi m BED & LAg- Avidity.
Phòng phỏng vấn Phòng xét nghi m
Tại phòng xét nghiệm
Nguyên tắc chung: Mẫu máu có thể thu thập vào bất kỳ thời gian nào thuận ti n nhất cho người tham gia.
- H t đủ 5 ml m u v o bơm kim ti m thường, khoảng 1-2 ml máu sẽ được giữ lại làm xét nghi m thường quy của PKNT về công thức máu, sinh hóa, huyết học…. Lượng máu cịn lại được bơm v o ống có áp lực chân kh ng EDTA đã d n mã nghiên cứu.
- Ly tâm mẫu ở 2000 vòng/phút trong 10 phút hay tự lắng trong vòng 2 giờ. Hút 0,5 ml huyết tương v o ống thứ nhất, phần huyết tương c n lại cho vào ống thứ hai, các ống nghi m 2 ml đựng huyết tương đều được dán mã nghiên cứu. Mẫu huyết tương ngay lập tức được lưu giữ vào tủ lạnh ở 4oC v được chuyển tới phịng thí nghi m HIV Vi n VSDTTƯ (một tuần 2 lần) và Vi n Pasteur Hồ Chí Minh (khi đủ 10 mẫu hoặc hai lần một tuần) theo quy đ nh của Bộ Y tế.
- Mẫu sau khi chuyển về các Vi n lập tức được lưu giữ ở tủ âm sâu (-20ᵒC) cho đến khi làm xét nghi m. Các mẫu huyết tương sẽ được làm tan ra và xét nghi m BED, LAg- Avidity ở hai th ng đầu và làm lại khi kết thúc nghiên cứu. Đối với mẫu huyết tương c n dư sau khi x t nghi m xong, cất giữ vào tủ lạnh ở - 80oC tại VSDTTƯ v Vi n Pasteur TP HCM để làm xét nghi m khác.
- Ống mẫu lưu 0,5 ml sẽ được chuyển bằng nitơ lỏng hoặc đ kh đến Atlanta (Mỹ) tại hai thời điểm: ở 2 th ng đầu và khi kết thúc nghiên cứu để kiểm tra chất lượng xét nghi m sau nghiên cứu hoặc làm thêm những xét nghi m kh c đối với những mẫu nghi ngờ.
2.1.7. Các yếu tố cần đánh giá trong nghiên cứu
- Phân tích ý nghĩa c c đặc điểm của quần thể tham gia nghiên cứu về: độ tuổi, giới tính, thời gian nhiễm; các kết quả xét nghi m HIV, CD4, đo tải lượng HIV với lâm sàng; các b nh nhiễm trùng cơ hội; các nhóm có nguy cơ cao).
- Phân tích tỷ l phân loại sai là mới nhiễm của từng sinh phẩm: sinh phẩm miễn d ch gắn enzym tóm bắt phân nhóm B, E, D (BED CEIA), sinh phẩm miễn d ch gắn enzym ái lực kháng nguyên giới hạn (LAg- Avidity).
- Xem x t c c trường hợp nghi ngờ bằng xét nghi m bổ sung: xét nghi m Western Blot, xét nghi m kiểu gen, xét nghi m đo tải lượng HIV.
- Phân tích tỷ l phân loại sai cho cả hai sinh phẩm sau khi loại những b nh nhân đang điều tr ARV.
- Phân tích tỷ l phân loại sai theo từng phòng khám ngoại trú theo từng miền. - Tìm hiểu, phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả tỷ l phân loại sai. - So sánh tỷ l phân loại sai, ngư ng OD cut-off của các nghiên cứu xét nghi m sớm HIV ở Vi t Nam với c c nước trên thế giới.
- Tính khả thi của các sinh phẩm khi áp dụng trong tương lai.
2.2. Ứng dụng kỹ thuật LAg Avidity để ước tính tỷ lệ mới nhiễm HIV-1 trong một số nhóm đối tượng có nguy cơ cao lây nhiễm HIV ở Việt Nam năm 2006 và 2009.
Đây l nghiên cứu hồi cứu, nghiên cứu ước tính tỷ l mới nhiễm HIV thực hi n 2012 - 2013, sử dụng lại tồn bộ thơng tin, các mẫu huyết tương được lưu giữ tại Vi n từ các nghiên cứu Lồng ghép các chỉ số hành vi và sinh h c (IBBS) vòng I (2006) và vịng II (2009).
2.2.1. Các thơng tin của nghiên cứu BBS đã thực hiện năm 2006, 2009
Đối tượng địa điểm và cỡ mẫu nghiên cứu
L c c đối tượng của nhóm nguy cơ cao gồm nghi n chích ma túy (NCMT), phụ nữ bán dâm (PNBD) và nam quan h tình dục đồng giới (MSM) đã được tiến h nh điều tra qua hai năm 2006 v 2009 trong h thống giám sát các chỉ số hành vi và sinh học (IBBS) tại Vi t Nam. Đảm bảo các tiêu chuẩn sau:
- Nhóm phụ nữ bán dâm: Từ 18 tuổi trở lên; có hành vi quan h tình dục (bao gồm cả đường âm đạo và hậu môn) với kh ch l ng chơi hoặc bạn tình bất chợt nhằm trao đổi tiền hoặc hàng hóa ít nhất 1 lần trong tháng qua; sẵn sàng hợp tác tham gia nghiên cứu; và đồng ý làm các xét nghi m HIV/STI và các xét nghi m có liên quan khác của nghiên cứu.
- Nhóm nghi n chích ma t y: Từ 18 tuổi trở l n; có hành vi tiêm chích ma túy trái phép ít nhất 1 lần trong th ng qua; sẵn s ng hợp t c tham gia nghi n cứu; và đồng ý l m c c x t nghi m HIV STI v c c x t nghi m có li n quan kh c của nghi n cứu.
- Nhóm nam quan h t nh dục đồng giới: Từ 16 tuổi trở l n; có hoạt động quan h t nh dục (b nh thường, qua mi ng hoặc hậu m n) với người đ n ng kh c ít nhất 1 lần trong 12 th ng qua; sẵn s ng tham gia nghi n cứu; và đồng ý l m c c x t nghi m HIV STI v c c x t nghi m có li n quan kh c của nghi n cứu.
Địa bàn điều tra
Nghiên cứu IBBS vòng I được triển khai năm 2005 -2006 tại 7 tỉnh Hà Nội, Hải Phòng, Quảng Ninh, Đ Nẵng, TP HCM, Cần Thơ v An Giang (NCMT và PNBD tại 7 tỉnh, MSM tại 2 tỉnh). Nghiên cứu IBBS vòng II được tiến h nh năm 2009-2010 tại 12 tỉnh Hà Nội. Hải Phòng, Quảng Ninh, Y n B i, Đi n Biên, Lào Cai, Ngh An, Đ Nẵng, Đồng Nai, TP HCM, Cần Thơ, v An Giang (NCMT tại 12 tỉnh, PNBD tại 11 tỉnh và MSM tại 4 tỉnh).
Quy trình thu th p mẫu tại các điểm nghiên cứu IBBS
- Tại phòng phỏng vấn: Đối tượng tham gia đối với nghiên cứu được phỏng vấn theo mẫu các phiếu được cung cấp (xem phụ lục bộ câu hỏi cho): Tiếp đón người tham gia nghiên cứu; Xác nhận đồng ý tham gia; và Thu thập thông tin, số li u về các nhóm: nam quan h tình dục đồng giới, nhóm các ch (phụ nữ bán dâm), nhóm các anh (nghi n chích ma túy).
- Tại phòng xét nghi m: Dán mã nghiên cứu lên các ống nghi m; H t đủ 5 ml máu v o bơm kim ti m thường, bơm m u v o ống EDTA 5ml; và Ly tâm mẫu ở 3000 vòng/phút trong 10 phút hay tự lắng trong vòng 2 giờ. Hút 0,7 ml huyết tương vào ống thứ nhất – sử dụng cho tỉnh để làm xét nghi m HIV thường quy tại tỉnh; phần huyết tương c n lại (1,8 ml) cho vào ống thứ hai chuyển về Vi n VSDTTƯ – các ống mẫu huyết tương n y ngay lập tức được lưu giữ vào tủ lạnh âm sâu -20C hoặc -80C, sử dụng cho các xét nghi m khác tại Vi n.
Các phiếu thu thập số li u, biểu mẫu xét nghi m, mẫu b nh phẩm từ các điểm nghiên cứu được chuyển thẳng về Vi n VTDTTƯ sau khi kết thúc nghiên cứu để tiến hành làm các xét nghi m cần thiết và phân tích.
2.2.2. h ơng pháp nghiên cứu tính tỷ lệ mới nhiễm HIV bằng sinh phẩm LAg- Avidity, sử dụng thông tin và mẫu IBBS 2006, 2009
Theo tài li u hướng dẫn của UNAIDS/WHO [115], cỡ mẫu cho từng nhóm
trong nghiên cứu n y được tính tốn dựa trên các số li u đầu vào của IBBS vòng I và IBBS vịng II. Các thơng số được đưa v o c ng thức SACEMA đã được đưa l n mạng thơng qua bảng tính. Vì vậy số lượng mẫu cần thiết cho nghiên cứu tìm tỷ l mới nhiễm n y được tính như bảng 2.1.
Bảng 2.1. Số lƣợng mẫu cần cho nghiên cứu ƣớc tính tỷ lệ mới nhiễm HIV t mẫu lƣu IBBS (2006, 2009)
Nhóm & năm ω CoV ω (%) PLS (%) CoV PLS (%) Tỷ lệ ện n ễm (%) Tỷ lệ n ễm ần đ y (%) Hệ số t ết kế (Design Effect) Số lƣợn mẫu ần cho nghiên ứu Số lƣợn mẫu sẵn ó NCMT 2006 141 7,40 2,33 15,11 36,30 5,00 1,2 2.070 2.018 2009 141 7,40 2,33 15,11 30,70 5,00 1,2 1.767 3.830 PNBD 2006 141 7,40 2,33 15,11 8,60 1,50 1,2 3.806 3.546 2009 141 7,40 2,33 15,11 8,50 1,50 1,2 3.785 5.457 MSM 2006 141 7,40 2,33 15,11 8,99 5,00 1,5 770 790 2009 141 7,40 2,33 15,11 13,67 5,00 1,5 1.278 1.596 Tổn số mẫu 13.476 17.237 Trong đó:
ω : số ngày trung bình thời gian mới nhiễm gần đây CoV ω : H số biến thiên của ω
PLS : Tỷ l phân loại sai
CoV PLS : H số biến thiên của phân loại sai
H số thiết kế : Hi u chỉnh cho những thiết kế chọn mẫu không phải là mẫu
Các yếu tố phân tích trong nghiên cứu
- Phân tích kết quả xét nghi m mới nhiễm HIV trên các nhóm PNBD, NCMT, MSM theo vùng.
- Phân loại các tỷ l hi n nhiễm và tỷ l mới nhiễm HIV trên từng nhóm riêng bi t: PNBD, NCMT theo vùng v năm triển khai IBBS, sử dụng tỷ l phân loại sai đã t m ra trong nghi n cứu trước đó với tỷ l phân loại sai của miền Bắc là 2,62%, tỷ l phân loại sai miền Nam là 0,69%.
- So sánh các tỷ l mới nhiễm HIV trên ba nhóm nguy cơ cao theo từng miền khác nhau và tỷ l phân loại sai khác nhau (theo kết quả tỷ l phân loại sai của nghiên cứu trước đó).
- Phân tích tính chính xác của kỹ thuật LAg-Avidity và tính khả thi khi áp dụng trong thực tế.
Ư ớc tính t ỷ l m ới nh iễ m HIV d ựa tr n PL S đã tí nh đư ợc từ nghiên cứ u trư ớc sử d ụng n gu ồn m ẫu t ừ đi ều tra IBBS 2 006 và 2009
Sử dụng tỷ l PLS theo từng miền ở nghiên cứu tr n để tính số lượng mẫu cần cho nghiên cứu này.
Sử dụng mẫu lưu của nghiên cứu IBBS 2006 & 2009, tổng mẫu chọn ra là những mẫu đã dương tính HIV theo chiến lược III-Bộ Y tế
Làm xét nghi m LAg- Avidity
XN sàng lọc: ODn> 2,0 với LAg - Avidity
XN khẳng đ nh: ODn >1,0 với LAg - Avidity
- XN khẳng đ nh: ODn ≤1,0 với LAg - Avidity;
- Western Blot khẳng đ nh lại mẫu l dương tính HIV thực.
Mới nhiễm
Làm tiếp XN đo tải lượng HIV
Mới nhiễm: ≥ 1000
bản sao/ml
Nhiễm lâu: < 1000
bản sao/ml
Đưa v o c ng thức ước tính tỷ
lệ mới nhiễm HIV
- Đ nh gi kết quả xét nghi m mới nhiễm bằng sinh phẩm LAg- Avidity tr n ba nhóm nguy cơ cao của điều tra IBBS.
- Phân loại các tỷ l hi n nhiễm và tỷ l mới nhiễm HIV trên từng nhóm riêng bi t.
- Đ nh gi kỹ thuật LAg-Avidity và tính khả thi khi áp dụng trong thực tế.
Nhiễm lâu
2.3. Các kỹ thuật xét nghiệm sử dụng trong hai nghiên cứu
2.3.1. Xét nghiệm BED-CEIA
Quy trình xét nghi m này thực hi n hai lần [111]: xét nghi m sàng lọc ban đầu và xét nghi m lại khẳng đ nh: mỗi mẫu làm lặp lại 3 lần trong một lần chạy theo hình 2.4.
Hìn 2.4. Sơ đồ xét nghiệm BED-CEIA trong nghiên cứu
*Giá trị m t độ quang của mẫu ODn được tính theo cơng thức:
(OD của chứng, mẫu hoặc chất chuẩn) ODn =
(trung v OD của chất chuẩn)
Trong đó OD chứng âm là giá tr trung bình cộng của 2 chứng; các chứng dương, CAL và mẫu khẳng đ nh thì OD là trung v của các giá tr .
Các mẫu có ODn* > 1,2 đƣợ xá địn đã
nhiễm lâu Xét nghiệm sàng lọc BED
Mỗi lần chạy gồm: 11 mẫu chứng (2 chứng âm lặp
lại, 3 chất chuẩn lặp lại, 3 chứng dương cao lặp lại, 3 chứng dương thấp lặp lại) và 85 mẫu
Nhập kết quả vào bảng số Exel
Xét nghiệm khẳn định BED
Mỗi lần chạy gồm: 11 mẫu chứng nh trên và 28 mẫu (với mỗi mẫu có ODn* ≤ 1 2 làm lặp lại 3 lần)
Nhập kết quả vào bảng số Exel
Các mẫu có ODn* > 0,8 đƣợ xá địn đã n ễm l u và ≤ 0,8 đƣợ xá định
Hình 2.5. Cá bƣớc thực hiện xét nghiệm BED-CEIA [36]
1) Chuẩn b nước rửa 1X
2) Trộn chứng và mẫu và pha loãng trong dung d ch pha loãng mẫu
3) Trộn chứng và mẫu 4-6 lần, nhỏ vào phiến và ủ 370C/1giờ 4) Rửa phiến
5) Pha loãng BED peptide, trộn đều, nhỏ phiến và ủ 370C/1giờ 6) Rửa phiến
7) Pha loãng cộng hợp, trộn đều, nhỏ phiến và ủ 370C/1.5giờ 8) Rửa phiến
9) Th m cơ chất và ủ chính xác 10) Dừng phản ứng 11) Đọc phiến 250C/15 phút
Quy trình thực hi n xét nghi m BED-CEIA như h nh 2.5 [103]:
- Ủ chứng và mẫu: lấy phiến có phủ kháng thể người IgG ra khỏi túi, sau khi pha loãng chứng và mẫu trộn đều 4-6 lần, chuyển 100 µl dung d ch pha loãng mẫu vào giếng (khơng có bọt), đậy kín phiến bằng miếng đậy phiến, ủ 37ᵒC ± 1ᵒC trong 1 giờ;
- Rửa phiến 4 lần với 300 µl dung d ch đ m rửa 1 lần để loại bỏ những kháng thể kh ng b m được vào giếng;
- Ủ BED peptide: khoảng 10 ph t trước khi ủ, pha loãng 1:1001 HIV-1 BED peptide với dung d ch pha lỗng mẫu vào ống nghi m falcon 15 µl (12 µl peptide + 12ml dung d ch pha lỗng mẫu), trộn đều bằng máy trộn mẫu (vortex), hút 100 µl hỗn hợp này nhỏ vào mỗi giếng, đậy phiến và ủ 37ᵒC ± 1ᵒC trong 1 giờ;
- Rửa phiến 4 lần như trên;
- Ủ cộng hợp: pha lỗng 1:1001 gồm 12 µl cộng hợp gắn enzym Streotavidin - HRP trong 12 ml dung d ch pha lỗng mẫu, nhỏ 100 µl dung d ch cộng hợp vào mỗi giếng, đậy phiến và ủ 37ᵒC ± 1ᵒC trong 1 giờ;
- Rửa phiến 4 lần như tr n;
- Nhỏ 100 µl cơ chất vào mỗi giếng, ủ 25ᵒC ± 1ᵒC trong chính xác 15 phút; - Nhỏ 100 µl dung d ch dừng phản ứng;
2.3.2. Quy trình kỹ thuật xét nghiệm mới LAg-Avidity EIA
Quy trình xét nghi m này thực hi n hai lần [104]: xét nghi m sàng lọc ban đầu, xét nghi m lại khẳng đ nh mỗi mẫu làm lặp lại 3 lần trong một lần chạy như hình 2.6.
Hình 2.6. Quy trình xét nghiệm LAg-Avidity
*Giá trị m t độ quang của mẫu ODn được tính theo cơng thức:
(OD của chứng, mẫu hoặc chất chuẩn) ODn =
(trung v OD của chất chuẩn)
Trong đó OD chứng âm là giá tr trung bình cộng của 2 chứng; các chứng dương, CAL và mẫu khẳng đ nh thì OD là trung v của các giá tr .