Hỡnh 2.20. Phổ 1H-NMR của thiohiđantoin XIg
N N O HS Br N NH S O H H 1 2 3 4 5
Rừ ràng cỏc dẫn xuất XIg-XVIIg tồn tại dưới dạng hai đồng phõn. Điều này là do sự cú mặt của nhúm Metyl ở vị trớ octo đối với dị vũng thiohidantoin, làm cản trở sự
quay tự do của liờn kết N-CAr.
1 2 3 4 5 X O N N HS N CH3 NH S R1 O
Nghiờn cứu cấu trỳc tinh thể bằng phương phỏp X-ray [89] của cỏc dẫn xuất loại này cho thấy dị vũng thiohidantoin là đồng phẳng, do đú khụng thể giải thớch được sự cú mặt của nhúm thế ở nhõn aryl cú thể ảnh hưởng tới lập thể của C-5 dẫn tới sự ưu tiờn của một trong hai đồng phõn quay. Sử dụng phương phỏp “computational method”, tỏc giả [60] đó nghiờn cứu quỏ trỡnh đồng phõn húa của cỏc hợp chất cú nhúm thế ở vị trớ octo của nhõn aryl so với dị vũng thiohidantoin và chỉ ra hai đồng phõn quay khụng đối quang của hợp chất này. Một đồng phõn bền hơn trong đú nhúm thế
octo thuộc nhõn aryl và nhúm thế R1 ở nguyờn tử C-5 ở cựng phớa mặt phẳng dị vũng
thiohidantoin (cisoid). Đồng phõn kộm bền hơn khi nhúm thế ở nhõn aryl và nhúm thế R1 tại nguyờn tử C-5 ở khỏc phớa mặt phẳng dị vũng thiohidantoin (transoid). Tớnh toỏn lý thuyết của tài liệu [60] đó chỉ ra năng lượng trạng thỏi cơ bản của hai đồng phõn khỏc nhau khoảng 0.16kcal/mol, cũn hàng rào năng lượng quay khỏc nhau khoảng 4.7kcal/mol. Khi đồng phõn ở dạng cisoid, nhúm thế octo của nhõn aryl sẽ ở gần
nguyờn tử oxi của liờn kết C=O, đồng phõn cũn lại nhúm thế octo này sẽ ở gần nguyờn tử lưu huỳnh của liờn kết C=S. Theo tớnh toỏn của tỏc giả [60], giả định rằng entropi của hai đồng phõn quay là như nhau, thỡ tỉ lệ trong cõn bằng của hai đồng phõn theo lý thuyết dao động trong khoảng 1.3 ở nhiệt độ phũng và phụ thuộc vào cỏc nhúm thế.
N N O HS CH3 N NH O S R1 H N N O HS CH3 N NH S O H R1 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Hỡnh 2.21. Cõn bằng hai đồng phõn quay của cỏc hợp chất XIg-XVIIg
Kết quả là phổ 1H-NMR của proton ở C-5 trong cỏc hợp chất XIg-XVIIg khụng
Hỡnh 2.22. Tương tỏc spin của proton H2C5 trong hợp chất XIg
Hỡnh 2.23. Tương tỏc spin của proton HC5 trong hợp chất XIIg
7 N NH S O CH3
Hỡnh 2.24. Tương tỏc spin của proton HC5 trong hợp chất XIIIg
Hỡnh 2.25. Tương tỏc spin của proton HC5 trong hợp chất XIVg
7 N NH S O CH2 CH3
Hỡnh 2.26. Tương tỏc spin của proton HC5 trong hợp chất XVg
Hỡnh 2.27. Tương tỏc spin của proton HC5 trong hợp chất XVIg
7 N NH S O CH2 CH2SCH3 7 N NH S O CH2 CH2COOH
Hỡnh 2.28. Tương tỏc spin của proton HC5 trong hợp chất XVIIg
Theo phõn tớch ở trờn, đồng phõn cisoid (nhúm CH3 và R1 ở vị trớ cis) bền hơn
đồng phõn transoid. Từ kết quả thực nghiệm phổ cho thấy, độ chuyển dịch của proton ở C-5 thuộc đồng phõn cisoid ở vựng trường cao hơn proton tương ứng thuộc đồng phõn transoid.
Như cú thể phỏn đoỏn, khi thay 1 hiđro ở C5 bằng cỏc nhúm thế kớch thước khỏc nhau, sự chờnh lệch về độ chuyển dịch húa học δcisoid-transoid của cỏc proton ở C5 cũng thay đổi. Nhúm thế R1 càng cồng kềnh, tỉ lệ đồng phõn cisoid/transoid
càng lớn. Đối với cỏc nhúm thế nghiờn cứu tỉ lệ này sắp xếp theo thứ tự sau -CH2CH2COOH > -CH(CH3)2 > -CH2C6H5 > -CH2CH3 > nhúm > -CH3 ~ -CH2CH2SCH3. Khi R1 = H, tỉ lệ này gần bằng 1, đồng thời xuất hiện tương tỏc gem
với giỏ trị hằng số tương tỏc spin 2J đạt gần 20Hz (bảng 2.11).
7 N NH S O CH2 C6H5
Bảng 2.11. Độ chuyển dịch húa học của cỏc proton trong đồng phõn quay cisoid
và transoid của cỏc hợp chất XI-VIIg
STT HC δH(trans)
(ppm) δH(cis) (ppm) Δδ (ppm) H(trans) /H(cis)
1 XIg 4.27 4.42 0.15 1.05 2 XIIg 4.46 4.60 0.14 1.22 3 XIIIg 4.42 4.53 0.11 1.74 4 XIVg 4.33 4.50 0.17 3.35 5 XVg 4.55 4.67 0.12 1.15 6 XVIg 4.47 4.59 0.12 3.43 7 XVIIg 4.79 4.91 0.12 2.06
Phổ khối lượng: được ghi bằng hai phương phỏp: Va chạm electron EI-MS
(70eV) trờn thiết bị Autospec Premier của hóng MICROMASS WATERS và phun mự vào điện trường ESI-MS trờn mỏy LTQ-orbitrap XL của hóng THERMOFISHER. Kết quả cho thấy tớn hiệu ion phõn tử thực tế thu được của cỏc dẫn xuất thiohiđantoin cú độ sai lệch rất bộ (~2%) so với khối lượng phõn tử tớnh toỏn theo lý thuyết.
* Phương phỏp va chạm electron EI-MS (70eV)
Từ kết quả phõn tớch phổ khối lượng và sử dụng phần mềm Mass Frontier cho phộp đề nghị sơ đồ phõn mảnh của cỏc hợp chất 2-thiohiđantoin như sau (hỡnh 2.29).
N C NH S O R1 N N O HS R +. N C NH S O N N O HS R -R1 N N O HS R NH S - [R1CH(CO)NH] NH C O N N O HS R - R1CHNH(CS)] N N O HS R - Thiohydantoin R N C NH S O R1 R OC N C NH S O R1 -[SHCNN] C N N N C NH S O R1 R -[SH-CO] -[Oxadiazolyl] N C NH S O R1 . (XI-XVIIa-g)
Hỡnh 2.29. Sơ đồ phõn mảnh đề nghị của cỏc dẫn xuất thiohidantoin điều chế được
ghi bằng phương phỏp ESI đều xuất hiện ở mode õm, cú lẽ là do quỏ trỡnh đề proton húa của nhúm SH ở phần dị vũng 1,3,4-oxađiazol-2-thiol (hỡnh 2.30).
N N O HS N NH S O R1 R -H+ R N HN S O R1 N N O S - m/z [M-H]-
Hỡnh 2.30. Sự hỡnh thành pic ion phõn tử thiohidantoin ở mode õm 2.4. Hoạt tớnh sinh học của cỏc hợp chất điều chế được 2.4. Hoạt tớnh sinh học của cỏc hợp chất điều chế được
2.4.1. Đỏnh giỏ hoạt tớnh bằng xỏc định đường kớnh vũng vụ khuẩn
Khảo sỏt hoạt tớnh sinh học bằng phương phỏp xỏc định đường kớnh vũng vụ khuẩn được thực hiện tại phũng Vi Sinh - Bệnh viện 19-8 Bộ Cụng An.
Cỏc chất được dựng thử hoạt tớnh:
- Dóy 1: cỏc dẫn xuất thioureidoaryl-1,3,4-oxadiaxol-2-thiol IIIa-g; - Dóy 2: cỏc dẫn xuất isothioxianat IVa-g;
- Dóy 3: cỏc dẫn xuất thiosemicacbazit Va,b,g; thiadiazol VIa, g; - Dóy 4: cỏc dẫn xuất (2-hiđroxietyl)thioure VIIa-d,g;
- Dóy 5: cỏc dẫn xuất thiazolin VIIIa-d,f;
- Dóy 6: cỏc dẫn xuất ngưng tụ với p-cloroanilin IXa-d,f,g; - Dóy 7: cỏc dẫn xuất quinazolin Xa-d,f,g;
- Dóy 8: cỏc dẫn xuất thiohidantoin XIa-g; XIIa-g; XIIIa,b,e-g; XIVa-g; XVa- d,f,g; XVIa-e,g; XVIIa-g.
Cỏc chủng vi khuẩn được dựng thử nghiệm: - Vi khuẩn Gram(-): E.coli.
- Vi khuẩn Gram(+): S. epidermidis và E. pider. - Chủng nấm men: C. albicans.
Dựng micropipet đưa một lượng nhất định dung dịch chất thử nghiệm nồng độ 3-5M (hoặc 1-2mg/ml) trong DMSO lờn giấy được cố định vi sinh vật kiểm định. Xử
được xỏc định bằng đường kớnh vựng ức chế sự phỏt triển của vi sinh vật (vũng vụ khuẩn) sau một thời gian ủ ở nhiệt độ tối ưu đối với mỗi chủng vi sinh vật. Kết quả thử hoạt tớnh sinh học của cỏc hợp chất thử nghiệm được thể hiện trờn hỡnh 2.31-2.33 và bảng 3.44 (xem phần thực nghiệm).
Vi khuẩn Gram (+)
+ Chủng E.Pider:
- Cú 10 hợp chất õm tớnh ở liều lượng 100μl, gồm VIIb-d; VIIa-d; XIc; XIVe,f và 5 hợp chất õm tớnh ở liều lượng 150μl, gồm VIId, VIIa-c, XIc.
- Cỏc hợp chất dương tớnh với đường kớnh vũng vụ khuẩn 22-33mm ở liều lượng 150μl gồm: thioure IIIa-g, IXa-d,f,g, isothioxianat IVa-g, cỏc
thiosemicacbazit Va,b,g, cỏc thiadiazol VIa,g và cỏc dẫn xuất thiohidantoin chứa Cl, Br, OH ở vị trớ octo của nhõn aryl trong hợp phần oxadiazol.
+ Chủng S.epidermidis:
- Cú 5 hợp chất cú hoạt tớnh: IIIa, IVa,b,g và XVIIb, trong đú 2 hợp chất IVb
và IVg cú đường kớnh vụ khuẩn 30mm ở liều lượng 100μl và 35mm ở 150μl.
Khuẩn Gram (-) E.coli
Cú 27 chất thử nghiệm cú hoạt tớnh với khuẩn E.coli: Vg; VIIc; VIIIf; IXa,b,d;
Xc,f; XIe,f; XIIa,b,d-g; XIIId-f; XIVa; XVa; XVId,e; XVIIe,f trong đú cú 8 hợp chất XIe, XIIb, XId,e; XIIId,e,f và XIVa cho đường kớnh vũng vụ khuẩn từ 17-26mm, cỏc
hợp chất cũn lại cho đường kớnh vụ khuẩn dao động trong khoảng 8-12mm.
Nấm men C.albicans
Kết quả trong bảng 3.44 (phần thực nghiệm) cho thấy hầu hết cỏc chất thử nghiệm đều cú khả năng chống nấm men, riờng cỏc hợp chất thuộc dóy thiosemicacbazit Va,b,g, cỏc hợp chất chứa vũng thiadiazol VIa,g cỏc thioure IXa-g và cỏc dẫn xuất thiohidantoin chứa Cl, Br, OH ở vị trớ octo của nhõn aryl trong hợp phần
oxađiazol cú hoạt tớnh cao, cho đường kớnh vũng vụ khuẩn từ 23-32mm ở liều lượng 150μl. Đõy là cỏc đối tượng cú thể dựng để nghiờn cứu tiếp theo để ứng dụng làm
Hỡnh 2.31. Mẫu thử với chủng
nấm men Candida albicans
Hỡnh 2.32. Mẫu thử với vi khuẩn
Gram (+) E.pidermidis
Hỡnh 2.33. Mẫu thử với vi khuẩn Gram (-) E.coli
2.4.2.Đỏnh giỏ hoạt tớnh thụng qua việc xỏc định nồng độ ức chế tối thiểu
Đỏnh giỏ hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm định bằng nồng độ ức chế tối thiểu dựa theo phương phỏp của Vanden Berghen (1994), được tiến hành trờn phiến vi lượng 96 giếng, với chất đối chứng là Amphoterilin B và Nystatin và thử nghiệm tại Viện húa học cỏc hợp chất thiờn nhiờn và Viện Húa học – Viện Hàn lõm KHCN Việt Nam.
Cỏc hợp chất dựng thử nghiệm: định hướng lựa chọn đối tượng thử nghiệm là dựa theo tài liệu, những hợp chất hữu cơ chứa halogen và cỏc nhúm OH trong nhõn phenyl thường cú hoạt tớnh sinh học cao, do đú trong cụng trỡnh này đó chọn cỏc chất
- Dóy 1: cỏc hợp chất chứa nhúm Br trong nhõn aryl IVe, Xe, XIVe, XVe, và XVIe. - Dóy 2: cỏc hợp chất chứa nhúm OH trong nhõn aryl IIIc, IVc, VIIc, VIId, IXc,
Xc,d; XIc, XIIc,d; XIIId, XIVd, XVIIc.
Cỏc chủng vi sinh vật kiểm định dựng thử nghiệm bao gồm: -Vi khuẩn Gr(-): E.coli, P.aeruginosa.
-Vi khuẩn Gr (+): B.subtillis, S.aureus. - Nấm mốc: A&P.niger, F.oxysporum. - Nấm men: C.albicans, S. cerevisiae.
Nấm và vi khuẩn được nuụi cấy và duy trỡ trong mụi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm) và được hoạt hoỏ trước khi tiến hành thử nghiệm. Mẫu chất thử được hoà tan trong dung dịch DMSO với 4-10 thang nồng độ được pha loóng từ dung dịch gốc rồi nhỏ sang phớm vi lượng 96 giếng. Sau khi được hoạt hoỏ, vi sinh vật kiểm định được pha loóng trong mụi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5 đơn vị MCLand (khoảng 108 vi sinh vật/1ml). Để trong tủ ấm 370C/24 giờ đối với vi khuẩn và 300C/48 giờ đối với nấm.
Sau đú, đọc kết quả và tớnh giỏ trị ức chế tối thiểu.
Kết quả thể hiện trờn bảng 3.45 (xem phần thực nghiệm) cho thấy, cỏc hợp chất dóy 1 cú 3 mẫu cho kết quả dương tớnh, trong đú hợp chất 5-(4-isothioxianato-2-
bromphenyl)-1,3,4-oxađiazol-2-thiol IVe cú hoạt tớnh với cả ba chủng: Khỏng
B. subtillis ở nồng độ 85,6àg/ml, khỏng chủng S.aureus ở nồng độ 98.1àg/ml, khỏng
chủng C.albicans ở nồng độ 77.2àg/ml. Hợp chất XIVe và XVIe khỏng chủng
B. subtillis ở nồng độ 81.1, 82.1àg/ml tương ứng.
Nhỡn chung, cỏc chất thuộc dóy 2 đều cú khả năng khỏng vi khuẩn Gram(+),
đặc biệt, thioure VIIc, IXc và quinazolin Xc cú tớnh khỏng cao. Thioure VIIc với nồng độ ức chế tối thiểu từ 12,5-50àg/ml cú khả năng khỏng 4 loại vi sinh vật kiểm định:
E.coli, B.subtillis, S.aureus, C.albicans, thioure IXc cũng khỏng được 4 loại:
P.aeruginosa, B.subtillis, F. oxysporum, S.cervisiae, cũn quinazolin Xc khỏng được 6
loại: 2 chủng Gram (-), hai chủng Gram (+) và hai chủng nấm men (bảng 3.46). Cả ba chất này đỏp ứng được quy tắc chọn lọc, là đối tượng được nghiờn cứu tiếp tục để cú thể sử dụng vào thực tiễn.
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM
3.1. Phương phỏp nghiờn cứu
- Phương phỏp tổng hợp hữu cơ truyền thống.
- Phương phỏp tổng hợp sử dụng năng lượng vi súng. - Phương phỏp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng.
- Phương phỏp tối ưu húa cấu trỳc sử dụng phần mềm Hyperchem 8.0. - Cỏc phương phỏp húa lớ hiện đại để xỏc định cấu trỳc: IR, NMR, HRMS. - Phần mềm Mass Frontier để xỏc định cơ chế phõn mảnh trong MS.
- Phương phỏp thử họat tớnh bằng đo đường kớnh vũng vụ khuẩn và phương phỏp xỏc định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
3.2. Hoỏ chất và thiết bị 3.2.1. Húa chất 3.2.1. Húa chất
- Tetrametylthiuram đisunfua: Dựng hoỏ chất kỹ thuật cú bỏn trờn thị trường được kết tinh lại trong clorofom, T0nc= 154-1560C (155-1560C [78]).
- Toluen, hiđrazin hiđrat, etanol, DMF, đioxan, benzen… dựng loại tinh khiết của TQ cú bỏn trờn thị trường và được cất lại trước khi dựng.
- HCl đặc, H2SO4 đặc, axit tosylic...dựng loại tinh khiết của TQ cú bỏn trờn thị trường. Dựng ngay khụng cần tinh chế.
- Axit p-aminobenzoic 99%, axit 4-aminosalixylic 99%, axit 5- aminosalixylic 99%, axit 4-metyl-3-aminobenzoic 99%, axit o-aminobenzoic 99%,
cỏc α-amino axit 99% là sản phẩm tinh khiết mua của Merck, được dựng khụng cần tinh chế. - 4-Cloroanilin 98%, loại P, sản phẩm của Sigma Aldrich, dựng khụng cần tinh chế.
3.2.2. Thiết bị
- Nhiệt độ núng chảy đo trờn mỏy SMP3, hóng Stuart Scientific (Mỹ), Bộ mụn Húa hữu cơ, Khoa Hoỏ học, Trường ĐH KHTN, ĐHQGHN.
- Phổ hồng ngoại đo trờn cỏc thiết bị:
+ Mỏy Spectrum GX-AUTOIMAGE ghộp nối kớnh hiển vi hồng ngoại, hóng Perkin Elmer trong khoảng 400-10.000 cm-1bằng ộp viờn KBr tại PTN Hoỏ Vật liệu, Khoa Hoỏ học, Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN.
+ Mỏy SIGNA của hóng Nicolet, Hoa Kỳ, tại Viện Hoỏ học,Viện khoa học và Cụng nghệ Việt Nam, mẫu ộp viờn với KBr đo bằng phương phỏp truyền qua.
- Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR, 13C-NMR, ghi trờn cỏc mỏy:
+ Bruker 500MV, 500 MHz tại Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. + Bruker 400MV, 400 MHz tại Viện khoa học Kĩ sư, Đại học Toulon - Var (ISITV), CH Phỏp.
+ Bruker 300MV, 300 MHz tại khoa Húa Dược, Đại học Rennes 1, CH Phỏp. Cỏc mẫu được ghi trong dung mụi DMSO-d6, sử dụng chất chuẩn nội TMS hoặc khụng dựng chất nội chuẩn.
- Phổ khối lượng ghi trờn cỏc mỏy:
+ LC/MS/MS LTQ Orbitrap XL phõn giải cao của hóng Thermo Scientific, USA tại PTN Hoỏ Vật liệu, Khoa Hoỏ học, Trường ĐH KHTN, ĐHQGHN.
+ GC/MS phõn giải cao AutoSpec Premier, hóng MICROMASS-WATERS tại PTN Hoỏ Vật liệu, Khoa Hoỏ học, Trường ĐH KHTN, ĐHQGHN.
- Thiết bị lũ vi súng Q-pro M, tại phũng Tổng hợp hữu cơ 3, Bộ mụn Húa hữu cơ, Khoa Hoỏ học, Trường ĐH KHTN, ĐHQGHN.
- Cõn phõn tớch Precisa XB 220A, độ chớnh xỏc 10-4, tại phũng Tổng hợp hữu cơ 3, Bộ mụn Húa hữu cơ, Khoa Hoỏ học, Trường ĐH KHTN, ĐHQGHN.
- Sắc ký bản mỏng được thực hiện với bản mỏng làm từ silicagel 60 F254 trỏng trờn lỏ nhụm của hóng Merck (Đức), hiển thị bằng iốt, KMnO4, đốn UV hai bước súng. - Silicagen chạy cột sắc ký dựng loại standard, cỡ hạt 63μm, hóng Merck.
- Mỏy đo gúc quay cực, Jasco P-2000, Khoa Hoỏ học, Trường ĐH KHTN, ĐHQGHN.
3.3. Thực nghiệm tổng hợp húa học
3.3.1. Tổng hợp cỏc dẫn xuất 5-thioureiđoaryl-1,3,4-oxađiazol-2-thiol 3.3.1.1. Tổng hợp cỏc aminobenzohiđrazit IIa-g 3.3.1.1. Tổng hợp cỏc aminobenzohiđrazit IIa-g
a) Điều chế cỏc este metyl 4-amino-2-R-benzoat Ia-g
Cỏc dẫn xuất metyl este aminobenzoat được điều chế theo tài liệu [1,20]. Hỗn hợp axit aminobenzoat và metanol dư được đun hồi lưu cỏch thủy trong vũng 8h với sự cú mặt của xỳc tỏc axit H2SO4 đặc. Sau khi xử lý và kết tinh lại sản phẩm trong đietyl ete thu được cỏc hợp chất Ia-g. Độ tinh khiết của sản phẩm được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng (dung mụi etyl axetat : toluen = 1:1) và đo nhiệt độ núng chảy.
Kết quả tổng hợp cỏc dẫn xuất Ia-g như sau: