2.1 .Địa chỉ và thời gian tiến hành
c. Phƣơng pháp định lƣợng giống vi khuẩn [12]
- Đếm mật độ tế bào bằng các đếm gián tiếp thông qua mối tƣơng quan giữa
mật độ tế bào và sự hấp thu quang ở bƣớc sóng 620nm. Từ đó xây dựng nên phƣơng trình đƣờng chuẩn.
- Đếm mật độ tế bào bằng các đếm gián tiếp là đếm số khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch đĩa petri:
Hút 1mL dung dịch cần xác định mật độ tế bào cho vào ống nghiệm có 9ml nƣớc muối sinh lý 0,9% đã hấp khử trùng ở 1210
C trong 30 phút, rồi lắc nhẹ đề đồng hóa mẫu. Tiếp tục hút 1mL dung dịch vừa pha loãng trong ống nghiệm cho
vào ống nghiệm tiếp theo cho đến ống thứ 6 ta có nồng độ pha lỗng lần lƣợt từ 10-1
đến 10-6 lần. Hút 0,1mL từ các độ pha loãng trên tiến hành cấy trang trên đĩa thạch
petri, đem ủ ở 320 – 370C chờ khuẩn lạc mọc lên. Ghi nhận kết quả bằng cách đếm
số lƣợng khuẩn lạc mọc trên đĩa Petri ở các nồng độ khác nhau. Áp dụng công thức để tính tốn:
Số tế bào / mL mẫu = (n / v).D
Trong đó: n - Số khuẩn lạc trung bình đếm đƣợc trên tất cả các đĩa Petri ở cùng một độ pha loãng.
v - Thể tích dịch mẫu đem cấy (0,1mL). D - hệ số pha loãng.
2.4.5. Khảo sát điều kiện thu hồi sinh khối a. Môi trƣờng nhân giống a. Môi trƣờng nhân giống
Tiến hành khảo sát trên 3 loại môi trƣờng: môi trƣờng dinh dƣỡng; môi trƣờng Pseudomonas; môi trƣờng nƣớc thải nhà máy chế biến dầu nhớt có bổ sung: pepton 10g/L, K2HPO4 1g/L, MgSO4 1g/L.
Mỗi loại trƣờng chuẩn bị 3 bình chứa 100ml mơi trƣờng ni cấy, cấy vi khuẩn vào các bình từ ống giống thạch nghiêng. Sau 48 h ni cấy ở nhiệt độ phịng, chế độ lắc 50 vòng/phút; tiến hành xác định mật độ tế bào.
b. Thời gian nhân giống
Chuẩn bị 4 bình chứa 100mL mơi trƣờng Pseudomonas, cấy vi khuẩn vào mỗi bình từ ống thạch nghiêng, ni cấy ở nhiệt độ phịng, chế độ lắc 50 vòng/phút.
Tiến hành xác định mật độ tế bào sau khoảng thời gian nuôi cấy lần lƣợt là 24h, 48h, 72h, 96h.
c. Vận tốc lắc
Chuẩn bị 4 nhóm mẫu, mỗi nhóm gồm 3 bình chứa 100mL mơi trƣờng Pseudomonas, cấy vi khuẩn vào mỗi bình từ ống giống thạch nghiêng. Tiến hành nuôi cấy ở các chế độ lắc là 0, 50, 100, 200 vòng/phút ở nhiệt độ phịng. Sau 48h ni cấy thì xác định mật độ tế bào ở các nhóm mẫu.
2.4.6. Khảo sát các điều kiện cho q trình xử lí bằng vi khuẩn tự do a. Nồng độ dầu khoáng trong nƣớc thải a. Nồng độ dầu khoáng trong nƣớc thải
Vì mục tiêu của nghiên cứu này là xử lý dầu khoáng trong nƣớc thải bằng vi khuẩn và cũng là nguồn cơ chất chủ yếu; nên phần khảo sát này thực hiện để đánh giá khả năng phát triển của vi khuẩn trên nồng độ cơ chất đầu vào của hệ thống.
Thống kê kết quả phân tích một số chỉ tiêu trong nƣớc thải đầu vào hệ thống xử lý của nhà máy chế biến dầu nhớt Đông Dƣơng trong bảng 2.1
Bảng 2.1: Kết quả phân tích nƣớc thải đầu vào hệ thống Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Kết quả Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Kết quả
pH - 5,23 – 5,93
Nhu cầu oxy sinh học (BOD5) mg/L 231 – 296
Nhu cầu oxy hóa học (COD) mg/L 418 – 633
Clorua (Cl-) mg/L 71,8 – 104
Tổng Phenol mg/L 2,1 – 3,6
Dầu mỡ khoáng mg/L 206,5 – 302,6
Tổng Nitơ mg/L 18,3 – 24,7
Tổng Photpho mg/L 4,3 – 6,8
Tiến hành khảo sát ở nồng độ dầu khoáng đầu vào từ 100 – 400mg/L; điều chỉnh nồng độ dầu khoáng bằng cách pha loãng hoặc bổ sung hỗn hợp Hexandecane:
Steraic (1:1), sau đó bổ sung mơi trƣờng 10 g/L pepton, K2HPO4 1g/L, MgSO4 1g/L.
Chuẩn bị 4 nhóm mẫu; mỗi nhóm gồm 4 bình có chứa 500 mL dung dịch nƣớc thải có nồng độ dầu khoáng lần lƣợt khoảng 400, 300, 200, 100 mg/L. Cấy vào mỗi bình một lƣợng giống với tỉ lệ 10% so với lƣợng dịch nƣớc thải, vận tốc lắc tối ƣu đã khảo sát trong phần thu sinh khối.
Sau 1, 3, 5, 7 ngày tiến hành theo dõi các chỉ tiêu COD, xác định nồng độ dầu mỡ khống cịn lại; ghi nhận lại kết quả thu đƣợc.
b. Nhiệt độ
Chuẩn bị 3 nhóm mẫu, mỗi nhóm gồm 4 bình, mỗi bình chứa 500mL dịch nƣớc thải của nhà máy chế biến dầu nhớt có bổ sung nitơ và phospho với tỉ lệ thích hợp, cấy vào mỗi bình 50mL dịch vi khuẩn theo tỉ lệ 10% giống, vận tốc lắc tối ƣu đã khảo sát trong phần thu sinh khối.
Ba nhóm bình nƣớc thải này đƣợc ni cấy lần lƣợt ở các điểm nhiệt độ lần lƣợt
là 30, 37, 450C. Chọn các khoảng nhiệt độ để đại diện cho điều kiện thời tiết ở Hồ
Chí Minh, nhiệt độ vào ban đêm vào khoảng 28 – 300C, còn ban ngày đặt biệt là buổi trƣa thì khoảng 420C.
Sau 1, 3, 5, 7 ngày tiến hành theo dõi các chỉ tiêu COD, xác định lƣợng dầu mỡ khống cịn lại và đếm mật độ tế bào của dung dịch nƣớc thải; ghi nhận lại kết quả thu đƣợc và rút ra kết luận.
Để biết đƣợc q trình xử lí xử dụng vi khuẩn đạt hiệu quả tới đâu thì kiểm tra COD, đây là chỉ tiêu đại diện cho nƣớc thải và mục tiêu xử lí dầu mỡ khống cho nên cần phải kiểm tra lƣợng dầu mỡ khoáng để biết đƣợc sự thay đổi COD là do đâu. Đếm mật độ tế bào trong q trình xử lí để theo dõi sự phát triển của vi khuẩn cho vào.
c. pH
Cũng chuẩn bị 3 nhóm mẫu, mỗi nhóm gồm 4 bình, mỗi bình chứa 500mL dịch nƣớc thải đã bổ sung nitơ và phospho. Điều chỉnh pH của mỗi nhóm lần lƣợt 5, 6, 7
bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N. Cấy vào mỗi bình một lƣợng giống với tỉ lệ 10% so với lƣợng dịch nƣớc thải, vận tốc lắc tối ƣu đã khảo sát.
Chuyển 3 nhóm bình vào ni cấy ở nhiệt độ đã khảo sát, tiến hành theo dõi COD, dầu mỡ khoáng, mật độ tế bào sau 1, 3, 5, 7 ngày; ghi nhận lại kết quả thí nghiệm để chọn pH thích hợp cho q trình.
d. Nồng độ NaCl
Chuẩn bị 4 nhóm bình có 500mL dịch nƣớc thải đã bổ sung nitơ và phospho. Bổ sung thêm vào mỗi bình NaCl lần lƣợt với nồng độ 0, 1, 2, 3, 4%; cấy vào mỗi bình 5ml giống. Sau 1, 3, 5, 7 ngày kiểm tra mật độ tế bào của các bình; ghi nhận kết quả thí nghiệm để biết đƣợc nồng độ muối tối đa mà vi khuẩn có thể sống và phát triển đƣợc.
2.4.7. Phƣơng pháp xử lý [5] a. Tạo bùn hoạt tính a. Tạo bùn hoạt tính
Chuẩn bị 150ml môi thƣờng Pseudomonas isolation khơng có agar trong bình
tam giác 250ml. Cấy một lƣợng giống với tỉ lệ 5% rồi nuôi cấy trên máy lắc 50 vịng/phút ở nhiệt độ thích hợp đã khảo sát trong 48h . Sau đó chuyển tồn bộ mơi trƣờng vào mơi trƣờng tạo bùn, lắc 50 vịng/phút.
Mơi trƣờng tạo bùn hoạt tính:
- Nƣớc thải của nhà máy đem về loại bỏ cặn, lấy dịch trong.
- Bổ sung thêm các chất: MgSO4 1,5 g/L; CaCl2 0,68 g/L; cân bằng nitơ và
phospho bằng NH4Cl và KH2PO4 tùy vào thành phần nƣớc thải lấy về.
Chỉnh pH của mơi trƣờng về khoảng thích hợp đã khảo sát ở trên, hấp khủ trùng ở 1210C trong 15 phút.
Sau khi cấy giống vào mơi trƣờng tạo bùn hoạt tính thì sau 48h thu bùn hoạt tính bằng cách gạn lọc phần dịch trong bỏ đi, giữ lại phẩn huyền phù bằng cách lý tâm 3000 vịng/phút.
Hình 2.2: Chụp chuẩn bị tạo bùn hoạt tính b. Tiến hành xử lý trên mơ hình b. Tiến hành xử lý trên mơ hình
Chuẩn bị 5 Lít nƣớc thải của nhà máy chế biến dầu nhớt. Xác định pH, COD, BOD5, tổng Nitơ, tổng Phospho, tổng dầu mỡ khoáng của nƣớc thải. Sau đó, bổ sung nguồn dinh dƣỡng, điều chỉnh pH thích hợp rồi hấp khử trùng, chứa trong bình nhựa hoặc thùng bất kì.
Chuẩn bị giống cấy theo điều kiện đã khảo sát, cấy giống vào với tỉ lệ tối ƣu, khuấy đảo với vận tốc tối ƣu để tạo hiếu khí.
Tiến hành theo dõi sự thay đổi của pH sau 24h một lần; theo dõi thay đổi COD, dầu mỡ khống 2 ngày 1 lần. Thí nghiệm kéo dài trong 30 ngày.
2.4.8. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu hóa lý a. Phƣơng pháp lấy mẫu a. Phƣơng pháp lấy mẫu
Mẫu đƣợc chứa trong bình bằng vật liệu PTFE và lấy tại hố thu gom nƣớc thải của hệ thống xử lý nƣớc thải trong công ty. Nƣớc thải phát sinh từ quá trình sản xuất, rửa thiết bị, rơi vải trong quá trình đóng gói, nƣớc thải có dung dịch hỗn hợp gồm nƣớc, dầu.
Nƣớc thải sau khi lấy đƣợc bảo quản lạnh trong thùng đá và mang về phịng thí nghiệm, mẫu đƣợc tiến hành thí nghiệm ngay.
b. Nhu cầu oxi hóa học (COD) theo SMEWW 5220C:2012 [29] c. Nồng độ dầu mỡ khoáng theo TCVN 5070:1995 [16] c. Nồng độ dầu mỡ khoáng theo TCVN 5070:1995 [16]
2.4.9. Phƣơng pháp khác
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH
Quá trình phân lập thu đƣợc 2 chủng vi khuẩn khả nghi là Pseudomonas đƣợc
đặt tên lần lƣợt là ĐD.P-1 và ĐD.P-2. Kết quả định danh bằng phƣơng pháp phân loại theo kiểu hình thu đƣợc 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas :
Chủng ĐD.P-1 là Pseudomonas aeruginosa với độ tƣơng đồng 99,8% Chủng ĐD.P-2 là Pseudomonas thermaerum với độ tƣơng đồng 98%
Trong quá trình phân lập thì chủng ĐD.P-1 chiếm đa số trên đĩa thạch chứng tỏ rằng mật độ tế bào cao hơn so với chủng ĐD.P-2. Nên nhóm nghiên cứu quyết định chọn chủng ĐD.P-1 để tiến hành khảo sát các điều kiện ảnh hƣởng.
Kết quả tìm tìm thấy vi khuẩn Pseudomonas trong nƣớc thải nhà máy chế biến
dầu nhớt Đông Dƣơng cũng tƣơng tự nhƣ các kết quả định danh vi khuẩn trong nƣớc thải nhiễm dầu bằng sinh học phân tử của Bùi Kim Anh [1], trong nƣớc nhiễm dầu ở Vũng Tàu, Quảng Ninh [2,7].
3.3. QUAN SÁT ĐẠI THỂ VÀ VI THỂ VI KHUẨN
Tiến hành trải đĩa và nhuộm gram để quan sát vi thể và đại thể của tế bào vi khuẩn Pseudomonas thu đƣợc 2 chủng vi khuẩn:
3.3.1. Chủng ĐD.P-1
Kết quả cấy ria trên môi trƣờng thạch đĩa Petri ở 320
C sau 2 ngày giúp quan sát đại thể của chủng ĐD.P-1 là những khuẩn lạc hình trịn, màu trắng sữa, có bề mặt lồi – trơn. Khuẩn lạc có kích thƣớc đƣờng kính từ 0,5 – 1mm.
Hình 3.1: Chụp đại thể tế bào chủng ĐD.P-1
Kết quả nhuộm Gram: tế bào chủng ĐD.P-1 là vi khuẩn Gram (-) nên bắt màu hồng của thuốc nhuộm Fushine và có hình que.
Hình 3.2: Chụp vi thể tế bào chủng ĐD.P-1 3.3.2. Chủng ĐD.P-2 3.3.2. Chủng ĐD.P-2
Kết quả cấy ria trên môi trƣờng thạch đĩa Petri ở 320
C sau 2 ngày giúp quan sát đại thể của chủng ĐD.P-2 là những khuẩn lạc hình trịn, màu vàng nhạt, có bề mặt lồi – trơn. Khuẩn lạc có kích thƣớc đƣờng kính từ 0,2 – 1mm.
Hình 3.3: Chụp đại thể tế bào Chủng ĐD.P-2
Kết quả nhuộm Gram: tế bào chủng ĐD.P-2 cũng là vi khuẩn Gram (-) nên bắt màu hồng của thuốc nhuộm Fushine và có hình cầu.
Hình 3.4: Chụp vi thể tế bào chủng ĐD.P-2
Giống vi khuẩn sau khi phân lập đƣợc bảo quản lạnh, đồng thời nhân giống cho quá trình khảo sát điều kiện ảnh hƣởng và xử lý.
3.3.3 Đƣờng chuẩn mật độ tế bào Pseudomonas aeruginosa ĐD.P-1
Chủng Pseudomonas ĐD.P-1 đƣợc chọn tiếp tục khảo sát, vì vậy đƣờng chuẩn tế bào đƣợc thiết lập. Kết quả đếm khuẩn lạc trên đĩa petri và độ hấp thu quang ở bƣớc sóng 620nm (OD 620nm) đƣợc trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.1: Kết quả mật độ tế bào và độ hấp thu quang P.aeruginosa ĐD.P-1 STT OD 620nm CFU/mL STT OD 620nm CFU/mL 1 0.0021 870 2 0.0047 2300 3 0.0216 9700 4 0.0692 35000 5 0.1028 52000 6 0.1462 82000 7 0.1794 117000
Hình 3.6: Đồ thị phƣơng trình đƣờng chuẩn chủng P.aeruginosa ĐD.P-1
Qua việc vẽ phƣơng trình đƣờng chuẩn ta có R2=0,995 > 0,99 nên phƣơng trình
đạt độ tin cậy để tính mật độ tế bào cho các thí nghiệm sau thơng qua đo mật độ quang.
3.4. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU SINH KHỐI 3.4.1. Môi trƣờng thu hồi sinh khối 3.4.1. Môi trƣờng thu hồi sinh khối
Để sản xuất chế phẩm sinh học, môi trƣờng và điều kiện ni cấy thu sinh khối đóng vai trị quan trọng đầu tiên. Trong khảo sát này, chọn môi trƣờng tăng sinh khối đƣợc thực hiện trƣớc để có thể thực hiện các khảo sát tiếp theo. Thí nghiệm tiến hành khảo sát trên 3 loại môi trƣờng: dinh dƣỡng, Pseudomonas (môi trƣờng chuyên biệt để tăng sinh vi khuẩn chi Pseudomonas), nƣớc thải nhiễm dầu mỡ
khoáng sau xử lý (bổ sung thêm pepton 10g/L, K2HPO4 1g/L, MgSO4 1g/L). Mỗi loại mơi trƣờng đƣợc chuẩn bị trong 2 bình có 100mL mơi trƣờng đã vơ trùng. Các mẫu môi trƣờng đều đƣợc cấy vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, lắc 50 vòng/phút. Sau 2 ngày tiến hành theo dõi mật độ tế bào thu đƣợc kết quả trong bảng 3.2
Bảng 3.2: Mật độ P.aeruginosa ĐD.P-1 trong các môi trƣờng khảo sát Môi trƣờng/pha lỗng OD 620nm CFU/mL SD Mơi trƣờng/pha loãng OD 620nm CFU/mL SD
Dinh dƣỡng/100 0.0518 2.7x106 9.3x104
Pseudomonas/1000 0.1073 5.8x107 3.0x106
NTSXL/10 0.0056 1.6x104 3.5x103
Kết quả thu đƣợc cho thấy trong môi trƣờng Pseudomonas thu đƣợc mật độ tế bào là cao nhất, tiếp theo là môi trƣờng dinh dƣỡng và nƣớc thải sau xử lý. Vì mơi trƣờng Pseudomonas có tính chọn lọc, hạn chế sự lây nhiễm nên đề tài chọn cho các thí nghiệm cần ni cấy, thu hồi sinh khối tiếp theo.
3.4.2. Thời gian nhân giống và vận tốc lắc
Chuẩn bị 10 bình thủy tinh 500mL chứa 100mL mơi trƣờng Pseudomonas, hấp vơ trùng sau đó tiến hành cấy giống vi khuẩn từ ống thạch nghiêng. Lấy 2 mẫu ký hiệu TG-01 và TG-02 nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, lắc 50 vòng/phút, theo dõi mật độ tế bào sau 24h, 48h, 72h, 96h. Đối với 8 mẫu còn lại đƣợc chia thành 4 nhóm với ký hiệu VT-00, VT-50, VT-100, VT-200 đƣợc nuôi cấy với vận tốc lắc 0, 50, 100, 200 vòng/phút ở nhiệt độ phòng và theo dõi mật độ tế bào sau 48h nuôi cấy. Tỉ lệ độ
lệch giữa các lần đo mật độ tế bào lặp lại (RSD%) nhỏ hơn 11%, mẫu đƣợc pha loãng 1000 lần và kết quả thu đƣợc nhƣ trong bảng 3.3
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy và vận tốc lắc chủng ĐD.P-1 Thời gian nuôi cấy CFU/mL Vận tốc lắc CFU/mL Thời gian nuôi cấy CFU/mL Vận tốc lắc CFU/mL
24 giờ 8.2x105 0 vòng/phút 6.9x107
48 giờ 4.8x107 50 vòng/phút 5.1x107
72 giờ 7.5x107 100 vòng/phút 3.7x107
96 giờ 5.9x106 200 vòng/phút 4.2x106
Qua khảo sát thời gian ni cấy thì sau thời gian 72h có kết quả mật độ tế bào đạt cao nhất, tiếp theo là sau thời gian 48h. Đối với khảo sát vận tốc lắc thì tăng vận
tốc lắc làm mật độ tế bào chủng ĐD.P-1 giảm. Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
có thể tồn tại đƣợc trong điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí, do trong mơi trƣờng ni cấy thì nguồn cung cấp nitơ chủ yếu là pepton nên Pseudomonas ĐD.P-1 thích nghi ở dạng yếm khí. Vì vậy mà khi nhân giống chủng P.aeruginosa trên môi trƣờng chọn lọc Pseudomonas thì nhu cầu oxy thấp.
Từ các kết quả khảo sát, đề tài sử dụng môi trƣờng Pseudomonas để tăng sinh, thời gian nhân giống khoảng 48h và vận tốc lắc 50 vòng/phút. Mặc dù lựa chọn chƣa phải là tối ƣu trong các khảo sát, nhƣng thời gian nhân giống 2 ngày đƣợc lựa để giảm thời gian chờ và vận tốc lắc 50 vịng/phút để tạo đồng đều mơi trƣờng.