2.1 .Địa chỉ và thời gian tiến hành
2.4. Phƣơng pháp thí nghiệm
Hình 2.1: Quy trình các bƣớc thực hiện thí nghiệm
Nƣớc thải nhiễm dầu
Phân lập và định danh
Khảo sát điều kiện xử lý Khảo sát điều kiện nhân giống
Ứng dụng xử lý nƣớc thải Môi trƣờng đặc hiệu
Gởi mẫu định danh
- Môi trƣờng nuôi cấy - Thời gian nuôi cấy - Vận tốc lắc
- Nồng độ dầu khống - Nhiệt độ mơi trƣờng - pH môi trƣờng - Nồng độ Muối
2.4.1. Phân lập giống [15]
Chuẩn bị môi trƣờng chọn lọc Pseudomonas Isolation agar, đƣợc hấp khử trùng, đổ ra đĩa petri.
Mẫu nƣớc thải nhiễm dầu sau khi lấy về đem pha loãng trong ống nghiệm chứa 9mL nƣớc muối sinh lý 0,9% đã chuẫn bị sẵn và hấp khử trùng. Tiến hành pha loãng mẫu nƣớc thải tử 1 đến 4 lần. Tại mỗi nồng độ pha loãng dùng pipetman hút 0,1mL cho vào đĩa petri cho chứa môi trƣờng chuyên biệt rồi dùng que cấy trang ra
cho đều trên mặt đĩa, đem ủ trong tủ ấm từ 320
C đến 370C sau 1 – 2 ngày đợi khuẩn
lạc phát triển. Chọn các khóm khuẩn lạc nghi ngờ cấy ria bằng que cấy vịng lên mơi trƣờng thạch đĩa petri, và cứ tiếp tục cấy ria cho đến khi khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch đĩa là thuần chủng (không bị tạp nhiễm).
Cấy ria bằng cách: dùng que cấy vịng phớt nhẹ lên khóm khuẩn lạc cần cấy rồi ria 3 đƣờng trên môi trƣờng thạch đĩa petri lần thứ nhất. Sau đó đốt que cấy trên ngọn lửa đèn cồn rồi phớt 3 đƣờng tiếp trên mặt đĩa sao cho song song nhau và cắt 3
đƣờng ban đầu. Làm tiếp nhƣ vậy lần nữa, sau đó ủ từ 320C đến 370C trong 1 – 2
ngày.
Giống sau khi đạt thuần chủng thì đem cấy lên mơi trƣờng thạch nghiêng trong ống nghiệm đã chuẩn bị từ trƣớc. Giữ giống trong tủ lạnh từ 20 – 80.
2.4.2. Định danh chủng vi sinh vật
Phƣơng pháp phân loại vi khuẩn bằng phƣơng pháp phân loại theo kiểu hình sử dụng kit API 20E (BioMerieux Marcy, Pháp). Theo nhà cung cấp, hệ thống API 20E chỉ dùng để phân loại các nhóm vi khuẩn hình que, Gram âm, khơng thuộc họ
Enterobacteraceae. Ngồi các đặc tính theo API 20E, các đặc điểm kỵ khí khơng
bắt buộc và kháng tetraxyclin đã đƣợc xác định. Đặc điểm kỵ khí khơng bắt buộc đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp cấy thẳng đứng vào mơi trƣờng LB rắn có chiều
cao 10 cm trong ống nghiệm; mẫu đƣợc ủ ở 300C và đọc kết quả sinh trƣởng sau 24
và 48 giờ ủ.
2.4.3. Phƣơng pháp giữ giống vi khuẩn [12,15]
Cho môi trƣờng vào ống nghiệm bịt kín bằng nút bông không thấm nƣớc, rồi
mang đi hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút.
Dùng que cấy móc lấy một ít vi khuẩn trong đĩa petri, cấy vi khuẩn vào ống thạch nghiêng theo hình chữ Z, đem ủ từ 320C đến 370C sau 1 – 2 ngày thì bảo quản mẫu ở nhiệt độ 20 – 80C. Cứ chu kỳ một tháng thì ta cấy chuyền qua ống thạch nghiêng một lần.
Chuẩn bị 2 ống cryotube có chứa 1mL glycerol trung tính vơ trùng. Sau đó, lấy 1 que cấy khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng, nghiền vào ống có chứa glycerol, để ở tủ
lạnh -200C, tránh đông và tan bang nhiều lần. Cấy chuyển sau 12 tháng.
2.4.4. Khảo sát đặt tính sinh học của giống [12] a. Quan sát vi thể bằng cấy trang a. Quan sát vi thể bằng cấy trang
Giống từ đĩa phân lập giống, dùng que cấy vòng lấy một ít pha vào nƣớc muối sinh lý 0,9%. Hút 0,1mL dung dịch cho vào đĩa petri chứa sẵn môi trƣờng đã hấp
khử trùng, tiến hành trang đĩa, đem ủ ở 320 – 370C từ 1-2 ngày chờ khuẩn lạc mọc
lên. Chúng tôi quan sát và mô tả vi thể (khuẩn lạc) của vi khuẩn.
b. Quan sát đại thể bằng phƣơng pháp nhuộm Gram
Thực hiện tiêu bản giọt ép từ canh trƣờng nƣớc muối sinh lý có giống vi khuẩn. Sau khi có tiêu bản giọt ép, chúng tơi thực hiện nhuộm Gram để quan sát. Cách tiến hành:
- Dàn mỏng thành vết bôi.
- Cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn (tránh làm nóng quá).
- Nhuộm Crystal violet 1 phút.
- Nhuộm Lugol (iodine) 0,5–1phút.
- Tẩy cồn.
- Rửa nƣớc, để khô.
- Nhuộm Fuchsin 1 phút.
- Rửa nƣớc.
- Khô tự nhiên.
- Quan sát dƣới kính hiển vi
c. Phƣơng pháp định lƣợng giống vi khuẩn [12]
- Đếm mật độ tế bào bằng các đếm gián tiếp thông qua mối tƣơng quan giữa
mật độ tế bào và sự hấp thu quang ở bƣớc sóng 620nm. Từ đó xây dựng nên phƣơng trình đƣờng chuẩn.
- Đếm mật độ tế bào bằng các đếm gián tiếp là đếm số khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch đĩa petri:
Hút 1mL dung dịch cần xác định mật độ tế bào cho vào ống nghiệm có 9ml nƣớc muối sinh lý 0,9% đã hấp khử trùng ở 1210
C trong 30 phút, rồi lắc nhẹ đề đồng hóa mẫu. Tiếp tục hút 1mL dung dịch vừa pha loãng trong ống nghiệm cho
vào ống nghiệm tiếp theo cho đến ống thứ 6 ta có nồng độ pha lỗng lần lƣợt từ 10-1
đến 10-6 lần. Hút 0,1mL từ các độ pha loãng trên tiến hành cấy trang trên đĩa thạch
petri, đem ủ ở 320 – 370C chờ khuẩn lạc mọc lên. Ghi nhận kết quả bằng cách đếm
số lƣợng khuẩn lạc mọc trên đĩa Petri ở các nồng độ khác nhau. Áp dụng cơng thức để tính tốn:
Số tế bào / mL mẫu = (n / v).D
Trong đó: n - Số khuẩn lạc trung bình đếm đƣợc trên tất cả các đĩa Petri ở cùng một độ pha loãng.
v - Thể tích dịch mẫu đem cấy (0,1mL). D - hệ số pha loãng.
2.4.5. Khảo sát điều kiện thu hồi sinh khối a. Môi trƣờng nhân giống a. Môi trƣờng nhân giống
Tiến hành khảo sát trên 3 loại môi trƣờng: môi trƣờng dinh dƣỡng; môi trƣờng Pseudomonas; môi trƣờng nƣớc thải nhà máy chế biến dầu nhớt có bổ sung: pepton 10g/L, K2HPO4 1g/L, MgSO4 1g/L.
Mỗi loại trƣờng chuẩn bị 3 bình chứa 100ml mơi trƣờng ni cấy, cấy vi khuẩn vào các bình từ ống giống thạch nghiêng. Sau 48 h ni cấy ở nhiệt độ phịng, chế độ lắc 50 vòng/phút; tiến hành xác định mật độ tế bào.
b. Thời gian nhân giống
Chuẩn bị 4 bình chứa 100mL mơi trƣờng Pseudomonas, cấy vi khuẩn vào mỗi bình từ ống thạch nghiêng, ni cấy ở nhiệt độ phịng, chế độ lắc 50 vòng/phút.
Tiến hành xác định mật độ tế bào sau khoảng thời gian nuôi cấy lần lƣợt là 24h, 48h, 72h, 96h.
c. Vận tốc lắc
Chuẩn bị 4 nhóm mẫu, mỗi nhóm gồm 3 bình chứa 100mL môi trƣờng Pseudomonas, cấy vi khuẩn vào mỗi bình từ ống giống thạch nghiêng. Tiến hành nuôi cấy ở các chế độ lắc là 0, 50, 100, 200 vòng/phút ở nhiệt độ phịng. Sau 48h ni cấy thì xác định mật độ tế bào ở các nhóm mẫu.
2.4.6. Khảo sát các điều kiện cho q trình xử lí bằng vi khuẩn tự do a. Nồng độ dầu khoáng trong nƣớc thải a. Nồng độ dầu khống trong nƣớc thải
Vì mục tiêu của nghiên cứu này là xử lý dầu khoáng trong nƣớc thải bằng vi khuẩn và cũng là nguồn cơ chất chủ yếu; nên phần khảo sát này thực hiện để đánh giá khả năng phát triển của vi khuẩn trên nồng độ cơ chất đầu vào của hệ thống.
Thống kê kết quả phân tích một số chỉ tiêu trong nƣớc thải đầu vào hệ thống xử lý của nhà máy chế biến dầu nhớt Đông Dƣơng trong bảng 2.1
Bảng 2.1: Kết quả phân tích nƣớc thải đầu vào hệ thống Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Kết quả Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Kết quả
pH - 5,23 – 5,93
Nhu cầu oxy sinh học (BOD5) mg/L 231 – 296
Nhu cầu oxy hóa học (COD) mg/L 418 – 633
Clorua (Cl-) mg/L 71,8 – 104
Tổng Phenol mg/L 2,1 – 3,6
Dầu mỡ khoáng mg/L 206,5 – 302,6
Tổng Nitơ mg/L 18,3 – 24,7
Tổng Photpho mg/L 4,3 – 6,8
Tiến hành khảo sát ở nồng độ dầu khoáng đầu vào từ 100 – 400mg/L; điều chỉnh nồng độ dầu khoáng bằng cách pha loãng hoặc bổ sung hỗn hợp Hexandecane:
Steraic (1:1), sau đó bổ sung mơi trƣờng 10 g/L pepton, K2HPO4 1g/L, MgSO4 1g/L.
Chuẩn bị 4 nhóm mẫu; mỗi nhóm gồm 4 bình có chứa 500 mL dung dịch nƣớc thải có nồng độ dầu khống lần lƣợt khoảng 400, 300, 200, 100 mg/L. Cấy vào mỗi bình một lƣợng giống với tỉ lệ 10% so với lƣợng dịch nƣớc thải, vận tốc lắc tối ƣu đã khảo sát trong phần thu sinh khối.
Sau 1, 3, 5, 7 ngày tiến hành theo dõi các chỉ tiêu COD, xác định nồng độ dầu mỡ khống cịn lại; ghi nhận lại kết quả thu đƣợc.
b. Nhiệt độ
Chuẩn bị 3 nhóm mẫu, mỗi nhóm gồm 4 bình, mỗi bình chứa 500mL dịch nƣớc thải của nhà máy chế biến dầu nhớt có bổ sung nitơ và phospho với tỉ lệ thích hợp, cấy vào mỗi bình 50mL dịch vi khuẩn theo tỉ lệ 10% giống, vận tốc lắc tối ƣu đã khảo sát trong phần thu sinh khối.
Ba nhóm bình nƣớc thải này đƣợc nuôi cấy lần lƣợt ở các điểm nhiệt độ lần lƣợt
là 30, 37, 450C. Chọn các khoảng nhiệt độ để đại diện cho điều kiện thời tiết ở Hồ
Chí Minh, nhiệt độ vào ban đêm vào khoảng 28 – 300C, còn ban ngày đặt biệt là buổi trƣa thì khoảng 420C.
Sau 1, 3, 5, 7 ngày tiến hành theo dõi các chỉ tiêu COD, xác định lƣợng dầu mỡ khống cịn lại và đếm mật độ tế bào của dung dịch nƣớc thải; ghi nhận lại kết quả thu đƣợc và rút ra kết luận.
Để biết đƣợc q trình xử lí xử dụng vi khuẩn đạt hiệu quả tới đâu thì kiểm tra COD, đây là chỉ tiêu đại diện cho nƣớc thải và mục tiêu xử lí dầu mỡ khống cho nên cần phải kiểm tra lƣợng dầu mỡ khoáng để biết đƣợc sự thay đổi COD là do đâu. Đếm mật độ tế bào trong q trình xử lí để theo dõi sự phát triển của vi khuẩn cho vào.
c. pH
Cũng chuẩn bị 3 nhóm mẫu, mỗi nhóm gồm 4 bình, mỗi bình chứa 500mL dịch nƣớc thải đã bổ sung nitơ và phospho. Điều chỉnh pH của mỗi nhóm lần lƣợt 5, 6, 7
bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N. Cấy vào mỗi bình một lƣợng giống với tỉ lệ 10% so với lƣợng dịch nƣớc thải, vận tốc lắc tối ƣu đã khảo sát.
Chuyển 3 nhóm bình vào ni cấy ở nhiệt độ đã khảo sát, tiến hành theo dõi COD, dầu mỡ khoáng, mật độ tế bào sau 1, 3, 5, 7 ngày; ghi nhận lại kết quả thí nghiệm để chọn pH thích hợp cho q trình.
d. Nồng độ NaCl
Chuẩn bị 4 nhóm bình có 500mL dịch nƣớc thải đã bổ sung nitơ và phospho. Bổ sung thêm vào mỗi bình NaCl lần lƣợt với nồng độ 0, 1, 2, 3, 4%; cấy vào mỗi bình 5ml giống. Sau 1, 3, 5, 7 ngày kiểm tra mật độ tế bào của các bình; ghi nhận kết quả thí nghiệm để biết đƣợc nồng độ muối tối đa mà vi khuẩn có thể sống và phát triển đƣợc.
2.4.7. Phƣơng pháp xử lý [5] a. Tạo bùn hoạt tính a. Tạo bùn hoạt tính
Chuẩn bị 150ml mơi thƣờng Pseudomonas isolation khơng có agar trong bình
tam giác 250ml. Cấy một lƣợng giống với tỉ lệ 5% rồi nuôi cấy trên máy lắc 50 vòng/phút ở nhiệt độ thích hợp đã khảo sát trong 48h . Sau đó chuyển tồn bộ mơi trƣờng vào mơi trƣờng tạo bùn, lắc 50 vịng/phút.
Mơi trƣờng tạo bùn hoạt tính:
- Nƣớc thải của nhà máy đem về loại bỏ cặn, lấy dịch trong.
- Bổ sung thêm các chất: MgSO4 1,5 g/L; CaCl2 0,68 g/L; cân bằng nitơ và
phospho bằng NH4Cl và KH2PO4 tùy vào thành phần nƣớc thải lấy về.
Chỉnh pH của mơi trƣờng về khoảng thích hợp đã khảo sát ở trên, hấp khủ trùng ở 1210C trong 15 phút.
Sau khi cấy giống vào mơi trƣờng tạo bùn hoạt tính thì sau 48h thu bùn hoạt tính bằng cách gạn lọc phần dịch trong bỏ đi, giữ lại phẩn huyền phù bằng cách lý tâm 3000 vịng/phút.
Hình 2.2: Chụp chuẩn bị tạo bùn hoạt tính b. Tiến hành xử lý trên mơ hình b. Tiến hành xử lý trên mơ hình
Chuẩn bị 5 Lít nƣớc thải của nhà máy chế biến dầu nhớt. Xác định pH, COD, BOD5, tổng Nitơ, tổng Phospho, tổng dầu mỡ khoáng của nƣớc thải. Sau đó, bổ sung nguồn dinh dƣỡng, điều chỉnh pH thích hợp rồi hấp khử trùng, chứa trong bình nhựa hoặc thùng bất kì.
Chuẩn bị giống cấy theo điều kiện đã khảo sát, cấy giống vào với tỉ lệ tối ƣu, khuấy đảo với vận tốc tối ƣu để tạo hiếu khí.
Tiến hành theo dõi sự thay đổi của pH sau 24h một lần; theo dõi thay đổi COD, dầu mỡ khoáng 2 ngày 1 lần. Thí nghiệm kéo dài trong 30 ngày.
2.4.8. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu hóa lý a. Phƣơng pháp lấy mẫu a. Phƣơng pháp lấy mẫu
Mẫu đƣợc chứa trong bình bằng vật liệu PTFE và lấy tại hố thu gom nƣớc thải của hệ thống xử lý nƣớc thải trong công ty. Nƣớc thải phát sinh từ quá trình sản xuất, rửa thiết bị, rơi vải trong q trình đóng gói, nƣớc thải có dung dịch hỗn hợp gồm nƣớc, dầu.
Nƣớc thải sau khi lấy đƣợc bảo quản lạnh trong thùng đá và mang về phịng thí nghiệm, mẫu đƣợc tiến hành thí nghiệm ngay.
b. Nhu cầu oxi hóa học (COD) theo SMEWW 5220C:2012 [29] c. Nồng độ dầu mỡ khoáng theo TCVN 5070:1995 [16] c. Nồng độ dầu mỡ khoáng theo TCVN 5070:1995 [16]
2.4.9. Phƣơng pháp khác
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH
Quá trình phân lập thu đƣợc 2 chủng vi khuẩn khả nghi là Pseudomonas đƣợc
đặt tên lần lƣợt là ĐD.P-1 và ĐD.P-2. Kết quả định danh bằng phƣơng pháp phân loại theo kiểu hình thu đƣợc 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas :
Chủng ĐD.P-1 là Pseudomonas aeruginosa với độ tƣơng đồng 99,8% Chủng ĐD.P-2 là Pseudomonas thermaerum với độ tƣơng đồng 98%
Trong quá trình phân lập thì chủng ĐD.P-1 chiếm đa số trên đĩa thạch chứng tỏ rằng mật độ tế bào cao hơn so với chủng ĐD.P-2. Nên nhóm nghiên cứu quyết định chọn chủng ĐD.P-1 để tiến hành khảo sát các điều kiện ảnh hƣởng.
Kết quả tìm tìm thấy vi khuẩn Pseudomonas trong nƣớc thải nhà máy chế biến
dầu nhớt Đông Dƣơng cũng tƣơng tự nhƣ các kết quả định danh vi khuẩn trong nƣớc thải nhiễm dầu bằng sinh học phân tử của Bùi Kim Anh [1], trong nƣớc nhiễm dầu ở Vũng Tàu, Quảng Ninh [2,7].
3.3. QUAN SÁT ĐẠI THỂ VÀ VI THỂ VI KHUẨN
Tiến hành trải đĩa và nhuộm gram để quan sát vi thể và đại thể của tế bào vi khuẩn Pseudomonas thu đƣợc 2 chủng vi khuẩn:
3.3.1. Chủng ĐD.P-1
Kết quả cấy ria trên môi trƣờng thạch đĩa Petri ở 320
C sau 2 ngày giúp quan sát đại thể của chủng ĐD.P-1 là những khuẩn lạc hình trịn, màu trắng sữa, có bề mặt lồi – trơn. Khuẩn lạc có kích thƣớc đƣờng kính từ 0,5 – 1mm.
Hình 3.1: Chụp đại thể tế bào chủng ĐD.P-1
Kết quả nhuộm Gram: tế bào chủng ĐD.P-1 là vi khuẩn Gram (-) nên bắt màu hồng của thuốc nhuộm Fushine và có hình que.
Hình 3.2: Chụp vi thể tế bào chủng ĐD.P-1 3.3.2. Chủng ĐD.P-2 3.3.2. Chủng ĐD.P-2
Kết quả cấy ria trên môi trƣờng thạch đĩa Petri ở 320
C sau 2 ngày giúp quan sát đại thể của chủng ĐD.P-2 là những khuẩn lạc hình trịn, màu vàng nhạt, có bề mặt lồi – trơn. Khuẩn lạc có kích thƣớc đƣờng kính từ 0,2 – 1mm.
Hình 3.3: Chụp đại thể tế bào Chủng ĐD.P-2
Kết quả nhuộm Gram: tế bào chủng ĐD.P-2 cũng là vi khuẩn Gram (-) nên bắt màu hồng của thuốc nhuộm Fushine và có hình cầu.
Hình 3.4: Chụp vi thể tế bào chủng ĐD.P-2
Giống vi khuẩn sau khi phân lập đƣợc bảo quản lạnh, đồng thời nhân giống cho quá trình khảo sát điều kiện ảnh hƣởng và xử lý.
3.3.3 Đƣờng chuẩn mật độ tế bào Pseudomonas aeruginosa ĐD.P-1