2.1 .Địa chỉ và thời gian tiến hành
d. Nồng độ NaCl
Chuẩn bị 4 nhóm bình có 500mL dịch nƣớc thải đã bổ sung nitơ và phospho. Bổ sung thêm vào mỗi bình NaCl lần lƣợt với nồng độ 0, 1, 2, 3, 4%; cấy vào mỗi bình 5ml giống. Sau 1, 3, 5, 7 ngày kiểm tra mật độ tế bào của các bình; ghi nhận kết quả thí nghiệm để biết đƣợc nồng độ muối tối đa mà vi khuẩn có thể sống và phát triển đƣợc.
2.4.7. Phƣơng pháp xử lý [5] a. Tạo bùn hoạt tính a. Tạo bùn hoạt tính
Chuẩn bị 150ml môi thƣờng Pseudomonas isolation khơng có agar trong bình
tam giác 250ml. Cấy một lƣợng giống với tỉ lệ 5% rồi nuôi cấy trên máy lắc 50 vòng/phút ở nhiệt độ thích hợp đã khảo sát trong 48h . Sau đó chuyển tồn bộ mơi trƣờng vào mơi trƣờng tạo bùn, lắc 50 vịng/phút.
Mơi trƣờng tạo bùn hoạt tính:
- Nƣớc thải của nhà máy đem về loại bỏ cặn, lấy dịch trong.
- Bổ sung thêm các chất: MgSO4 1,5 g/L; CaCl2 0,68 g/L; cân bằng nitơ và
phospho bằng NH4Cl và KH2PO4 tùy vào thành phần nƣớc thải lấy về.
Chỉnh pH của mơi trƣờng về khoảng thích hợp đã khảo sát ở trên, hấp khủ trùng ở 1210C trong 15 phút.
Sau khi cấy giống vào mơi trƣờng tạo bùn hoạt tính thì sau 48h thu bùn hoạt tính bằng cách gạn lọc phần dịch trong bỏ đi, giữ lại phẩn huyền phù bằng cách lý tâm 3000 vịng/phút.
Hình 2.2: Chụp chuẩn bị tạo bùn hoạt tính b. Tiến hành xử lý trên mơ hình b. Tiến hành xử lý trên mơ hình
Chuẩn bị 5 Lít nƣớc thải của nhà máy chế biến dầu nhớt. Xác định pH, COD, BOD5, tổng Nitơ, tổng Phospho, tổng dầu mỡ khoáng của nƣớc thải. Sau đó, bổ sung nguồn dinh dƣỡng, điều chỉnh pH thích hợp rồi hấp khử trùng, chứa trong bình nhựa hoặc thùng bất kì.
Chuẩn bị giống cấy theo điều kiện đã khảo sát, cấy giống vào với tỉ lệ tối ƣu, khuấy đảo với vận tốc tối ƣu để tạo hiếu khí.
Tiến hành theo dõi sự thay đổi của pH sau 24h một lần; theo dõi thay đổi COD, dầu mỡ khoáng 2 ngày 1 lần. Thí nghiệm kéo dài trong 30 ngày.
2.4.8. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu hóa lý a. Phƣơng pháp lấy mẫu a. Phƣơng pháp lấy mẫu
Mẫu đƣợc chứa trong bình bằng vật liệu PTFE và lấy tại hố thu gom nƣớc thải của hệ thống xử lý nƣớc thải trong công ty. Nƣớc thải phát sinh từ quá trình sản xuất, rửa thiết bị, rơi vải trong q trình đóng gói, nƣớc thải có dung dịch hỗn hợp gồm nƣớc, dầu.
Nƣớc thải sau khi lấy đƣợc bảo quản lạnh trong thùng đá và mang về phịng thí nghiệm, mẫu đƣợc tiến hành thí nghiệm ngay.
b. Nhu cầu oxi hóa học (COD) theo SMEWW 5220C:2012 [29] c. Nồng độ dầu mỡ khoáng theo TCVN 5070:1995 [16] c. Nồng độ dầu mỡ khoáng theo TCVN 5070:1995 [16]
2.4.9. Phƣơng pháp khác
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH
Quá trình phân lập thu đƣợc 2 chủng vi khuẩn khả nghi là Pseudomonas đƣợc
đặt tên lần lƣợt là ĐD.P-1 và ĐD.P-2. Kết quả định danh bằng phƣơng pháp phân loại theo kiểu hình thu đƣợc 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas :
Chủng ĐD.P-1 là Pseudomonas aeruginosa với độ tƣơng đồng 99,8% Chủng ĐD.P-2 là Pseudomonas thermaerum với độ tƣơng đồng 98%
Trong quá trình phân lập thì chủng ĐD.P-1 chiếm đa số trên đĩa thạch chứng tỏ rằng mật độ tế bào cao hơn so với chủng ĐD.P-2. Nên nhóm nghiên cứu quyết định chọn chủng ĐD.P-1 để tiến hành khảo sát các điều kiện ảnh hƣởng.
Kết quả tìm tìm thấy vi khuẩn Pseudomonas trong nƣớc thải nhà máy chế biến
dầu nhớt Đông Dƣơng cũng tƣơng tự nhƣ các kết quả định danh vi khuẩn trong nƣớc thải nhiễm dầu bằng sinh học phân tử của Bùi Kim Anh [1], trong nƣớc nhiễm dầu ở Vũng Tàu, Quảng Ninh [2,7].
3.3. QUAN SÁT ĐẠI THỂ VÀ VI THỂ VI KHUẨN
Tiến hành trải đĩa và nhuộm gram để quan sát vi thể và đại thể của tế bào vi khuẩn Pseudomonas thu đƣợc 2 chủng vi khuẩn:
3.3.1. Chủng ĐD.P-1
Kết quả cấy ria trên môi trƣờng thạch đĩa Petri ở 320
C sau 2 ngày giúp quan sát đại thể của chủng ĐD.P-1 là những khuẩn lạc hình trịn, màu trắng sữa, có bề mặt lồi – trơn. Khuẩn lạc có kích thƣớc đƣờng kính từ 0,5 – 1mm.
Hình 3.1: Chụp đại thể tế bào chủng ĐD.P-1
Kết quả nhuộm Gram: tế bào chủng ĐD.P-1 là vi khuẩn Gram (-) nên bắt màu hồng của thuốc nhuộm Fushine và có hình que.
Hình 3.2: Chụp vi thể tế bào chủng ĐD.P-1 3.3.2. Chủng ĐD.P-2 3.3.2. Chủng ĐD.P-2
Kết quả cấy ria trên môi trƣờng thạch đĩa Petri ở 320
C sau 2 ngày giúp quan sát đại thể của chủng ĐD.P-2 là những khuẩn lạc hình trịn, màu vàng nhạt, có bề mặt lồi – trơn. Khuẩn lạc có kích thƣớc đƣờng kính từ 0,2 – 1mm.
Hình 3.3: Chụp đại thể tế bào Chủng ĐD.P-2
Kết quả nhuộm Gram: tế bào chủng ĐD.P-2 cũng là vi khuẩn Gram (-) nên bắt màu hồng của thuốc nhuộm Fushine và có hình cầu.
Hình 3.4: Chụp vi thể tế bào chủng ĐD.P-2
Giống vi khuẩn sau khi phân lập đƣợc bảo quản lạnh, đồng thời nhân giống cho quá trình khảo sát điều kiện ảnh hƣởng và xử lý.
3.3.3 Đƣờng chuẩn mật độ tế bào Pseudomonas aeruginosa ĐD.P-1
Chủng Pseudomonas ĐD.P-1 đƣợc chọn tiếp tục khảo sát, vì vậy đƣờng chuẩn tế bào đƣợc thiết lập. Kết quả đếm khuẩn lạc trên đĩa petri và độ hấp thu quang ở bƣớc sóng 620nm (OD 620nm) đƣợc trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.1: Kết quả mật độ tế bào và độ hấp thu quang P.aeruginosa ĐD.P-1 STT OD 620nm CFU/mL STT OD 620nm CFU/mL 1 0.0021 870 2 0.0047 2300 3 0.0216 9700 4 0.0692 35000 5 0.1028 52000 6 0.1462 82000 7 0.1794 117000
Hình 3.6: Đồ thị phƣơng trình đƣờng chuẩn chủng P.aeruginosa ĐD.P-1
Qua việc vẽ phƣơng trình đƣờng chuẩn ta có R2=0,995 > 0,99 nên phƣơng trình
đạt độ tin cậy để tính mật độ tế bào cho các thí nghiệm sau thơng qua đo mật độ quang.
3.4. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU SINH KHỐI 3.4.1. Môi trƣờng thu hồi sinh khối 3.4.1. Môi trƣờng thu hồi sinh khối
Để sản xuất chế phẩm sinh học, môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy thu sinh khối đóng vai trị quan trọng đầu tiên. Trong khảo sát này, chọn môi trƣờng tăng sinh khối đƣợc thực hiện trƣớc để có thể thực hiện các khảo sát tiếp theo. Thí nghiệm tiến hành khảo sát trên 3 loại môi trƣờng: dinh dƣỡng, Pseudomonas (môi trƣờng chuyên biệt để tăng sinh vi khuẩn chi Pseudomonas), nƣớc thải nhiễm dầu mỡ
khoáng sau xử lý (bổ sung thêm pepton 10g/L, K2HPO4 1g/L, MgSO4 1g/L). Mỗi loại mơi trƣờng đƣợc chuẩn bị trong 2 bình có 100mL mơi trƣờng đã vô trùng. Các mẫu môi trƣờng đều đƣợc cấy vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, lắc 50 vòng/phút. Sau 2 ngày tiến hành theo dõi mật độ tế bào thu đƣợc kết quả trong bảng 3.2
Bảng 3.2: Mật độ P.aeruginosa ĐD.P-1 trong các môi trƣờng khảo sát Mơi trƣờng/pha lỗng OD 620nm CFU/mL SD Mơi trƣờng/pha lỗng OD 620nm CFU/mL SD
Dinh dƣỡng/100 0.0518 2.7x106 9.3x104
Pseudomonas/1000 0.1073 5.8x107 3.0x106
NTSXL/10 0.0056 1.6x104 3.5x103
Kết quả thu đƣợc cho thấy trong môi trƣờng Pseudomonas thu đƣợc mật độ tế bào là cao nhất, tiếp theo là môi trƣờng dinh dƣỡng và nƣớc thải sau xử lý. Vì mơi trƣờng Pseudomonas có tính chọn lọc, hạn chế sự lây nhiễm nên đề tài chọn cho các thí nghiệm cần ni cấy, thu hồi sinh khối tiếp theo.
3.4.2. Thời gian nhân giống và vận tốc lắc
Chuẩn bị 10 bình thủy tinh 500mL chứa 100mL mơi trƣờng Pseudomonas, hấp vơ trùng sau đó tiến hành cấy giống vi khuẩn từ ống thạch nghiêng. Lấy 2 mẫu ký hiệu TG-01 và TG-02 nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, lắc 50 vòng/phút, theo dõi mật độ tế bào sau 24h, 48h, 72h, 96h. Đối với 8 mẫu cịn lại đƣợc chia thành 4 nhóm với ký hiệu VT-00, VT-50, VT-100, VT-200 đƣợc nuôi cấy với vận tốc lắc 0, 50, 100, 200 vòng/phút ở nhiệt độ phòng và theo dõi mật độ tế bào sau 48h nuôi cấy. Tỉ lệ độ
lệch giữa các lần đo mật độ tế bào lặp lại (RSD%) nhỏ hơn 11%, mẫu đƣợc pha loãng 1000 lần và kết quả thu đƣợc nhƣ trong bảng 3.3
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy và vận tốc lắc chủng ĐD.P-1 Thời gian nuôi cấy CFU/mL Vận tốc lắc CFU/mL Thời gian nuôi cấy CFU/mL Vận tốc lắc CFU/mL
24 giờ 8.2x105 0 vòng/phút 6.9x107
48 giờ 4.8x107 50 vòng/phút 5.1x107
72 giờ 7.5x107 100 vòng/phút 3.7x107
96 giờ 5.9x106 200 vòng/phút 4.2x106
Qua khảo sát thời gian ni cấy thì sau thời gian 72h có kết quả mật độ tế bào đạt cao nhất, tiếp theo là sau thời gian 48h. Đối với khảo sát vận tốc lắc thì tăng vận
tốc lắc làm mật độ tế bào chủng ĐD.P-1 giảm. Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
có thể tồn tại đƣợc trong điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí, do trong mơi trƣờng ni cấy thì nguồn cung cấp nitơ chủ yếu là pepton nên Pseudomonas ĐD.P-1 thích nghi ở dạng yếm khí. Vì vậy mà khi nhân giống chủng P.aeruginosa trên mơi trƣờng chọn lọc Pseudomonas thì nhu cầu oxy thấp.
Từ các kết quả khảo sát, đề tài sử dụng môi trƣờng Pseudomonas để tăng sinh, thời gian nhân giống khoảng 48h và vận tốc lắc 50 vòng/phút. Mặc dù lựa chọn chƣa phải là tối ƣu trong các khảo sát, nhƣng thời gian nhân giống 2 ngày đƣợc lựa để giảm thời gian chờ và vận tốc lắc 50 vịng/phút để tạo đồng đều mơi trƣờng.
3.5. KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN CHO QUÁ TRÌNH XỬ LÝ 3.5.1. Nồng độ dầu khoáng trong nƣớc thải 3.5.1. Nồng độ dầu khống trong nƣớc thải
Kết quả phân tích một số chỉ tiêu trong nƣớc thải đầu vào hệ thống xử lý của nhà máy chế biến dầu nhớt Đông Dƣơng thể hiện trong bảng 3.4 trƣớc khi tiến hành các khảo sát.
Bảng 3.4: Kết quả phân tích nƣớc thải trƣớc khi thí nghiệm Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Kết quả Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Kết quả
pH - 5,68
Nhu cầu oxy hóa học (COD) mg/L 612
Dầu mỡ khoáng mg/L 293
Tổng Nitơ mg/L 22,6
Tổng Photpho mg/L 5,1
Với mục tiêu ứng dụng vi khuẩn P.aeruginosa để xử lý dầu mỡ khoáng, đề tài tiến hành khảo sát ở các khoảng là 400, 300, 200, 100 mg/L vì vậy ở khoảng khảo sát 200, 100mg/L sẽ tiến hành pha loãng mẫu, ở khoảng 400mg/L tiến hành bổ sung dầu khoáng bằng hỗn hợp Hexandecane : Steareic tỉ lệ 1: 1. Sau khi chuẩn bị
mẫu có nồng độ dầu mỡ khống thích hợp thì bổ sung thêm pepton 10g/L, K2HPO4
1g/L, MgSO4 1g/L. Mỗi khoảng khảo sát đƣợc chuẩn bị 7 bình chứa 500mL nƣớc
thải đƣợc đánh số thứ tự 1 – 7 rồi hấp khử trùng, sau đó cấy vào mỗi bình 10mL giống có mật độ tế bào là 5x107 CFU/mL, nuôi cấy ở nhiệt độ phịng và lắc 50 vịng/phút. Các bình đánh số 1 đƣợc xác định COD, dầu mỡ khoáng ngay sau khi chuẩn bị xong; các bình cịn lại đƣợc theo dõi sau 1, 3, 5, 7, 9, 12 ngày thu đƣợc kết quả nhƣ trong hình 3.7 và 3.8.
Hình 3.7: Ảnh hƣởng của nồng độ dầu mỡ khống đầu vào lên q trình xử lý nƣớc thải sử dụng P.aeruginosa ĐD.P-1
Bảng 3.5: Hiệu quả xử lý của P.aeruginosa ĐD.P-1 trên nồng độ dầu mỡ khoáng đầu vào
Hiệu quả xử lý ở nồng độ dầu mỡ khoáng sau 12 ngày ban đầu 200 mg/L đạt 81%, theo sau là 100, 300, 400 mg/L lần lƣợt là 77, 76, 66% thể hiện trong bảng 3.6. Kết quả theo dõi nồng độ dầu mỡ khoáng cho thấy hiệu quả xử lý giảm dần theo ngày, ở nồng độ 100mg/L từ ngày thứ 7 đến ngày 12 hầu nhƣ rất kém, đƣờng biểu diễn gần nhƣ đi ngang nhƣng kết quả đạt so với QCVN 29:2010/BTNMT cột B cho cửa hàng xăng dầu; ở nồng độ 200mg/L sau 12 ngày khảo sát thì lớn hơn 8mg/L. Khi nồng độ dầu mỡ khoáng tăng lên gây bất lợi cho vi khuẩn khi phát triển, tăng sinh, thích nghi.
Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự (2000) cũng đã khảo sát khả năng xử lý hydrocarbone thơm trong dầu Diezen. Tác giả thu đƣợc hiệu quả xử lý trung bình 87% đối với nồng độ Diezen ban đầu 0 – 8% sau 10 ngày khảo sát.
Hình 3.8: Biến đổi COD trong quá trình xử lý nƣớc thải với nồng độ dầu mỡ khoáng đầu vào khác nhau
Ký hiệu Thời gian (ngày) 400 mg/L 300 mg/L 200 mg/L 100 mg/L 1 10.0 8.2 10.4 16.3 3 27.6 33.8 39.8 38.8 5 35.7 51.5 48.3 55.1 7 47.4 62.5 58.2 63.3 9 57.5 72.4 69.2 69.4 12 66.3 76.5 81.1 77.6
Bảng 3.6: Hiệu quả xử lý COD với nồng độ dầu mỡ khoáng đầu vào khác nhau Ký hiệu Ký hiệu Thời gian (ngày) 400 mg/L 300 mg/L 200 mg/L 100 mg/L 3 0.0 0.0 0.0 0.0 5 16.3 14.4 12.5 12.1 7 27.3 28.6 34.9 25.9 9 33.0 33.2 37.2 33.3 12 36.9 39.3 44.7 49.4
Chỉ tiêu COD đƣợc phân tích để đánh giá mức độ ô nhiễm của nƣớc thải. Việc theo dõi COD trong nghiên cứu này cũng để đánh giá khả năng xử lý ô nhiễm khác
của vi khuẩn P.aeruginosa ĐD.P-1 đối với nƣớc thải. Kết quả theo dõi COD cho
thấy nhu cầu oxy tăng cao nhất ở ngày thứ 3 và giảm ở những ngày sau đó. Điều này chứng tỏ trong ba ngày đầu vi khuẩn phát triển mạnh sinh khối làm tăng COD, những ngày sau vi khuẩn thể hiện xử lý COD mạnh hơn do với một mật độ sinh khối đủ lớn, chuyển hóa chất hữu cơ trong nƣớc thải thành sinh khối xảy ra mạnh mẽ, khiến nhu cầu oxy hóa học giảm dần; sau 12 ngày về lại nhƣ ban đầu là do trong nƣớc thải sinh khối vẫn tăng lên. Hiệu quả giảm COD đƣợc tính dựa vào mức COD cao nhất (sau 3 ngày xử lý), giá trị này giảm khi nồng độ dầu khoáng ban đầu tăng dần.
Vì khả năng xử lý dầu mỡ khống của vi khuẩn P.aeruginosa ĐD.P-1 đạt hiệu
quả cao nhất 81% và COD giảm 44.7% so với ngày thứ 3 sau 12 ngày xử lý ở nồng độ 200 mg/L cho nên đề tài chuẩn bị nồng độ dầu mỡ khoáng đầu vào này cho các khảo sát tiếp theo.
3.5.2. Nhiệt độ ni cấy
Vì điều kiện thời tiết ở Hồ Chí Minh, nhiệt độ vào ban đêm vào khoảng 28 – 300C, còn ban ngày đặt biệt là buổi trƣa thì khoảng 420
C mà các hệ thống xử lý đƣợc đặt chủ yếu ngồi trời, chỉ có mai che để chống tràn do mƣa. Cho nên, đề tài tiến hành khảo sát ở 3 khoảng nhiệt độ là 30, 37, 450C. Chuẩn bị 19 bình chứa 500mL nƣớc thải có dầu mỡ khống khoảng 200 mg/L tƣơng tự nhƣ phần khảo sát nồng độ dầu mỡ khoáng nƣớc thải. Tiếp theo, các mẫu đƣợc hấp khử trùng rồi cấy
vào đó 10 mL giống vi khuẩn có mật độ tế bào là 5x107 CFU/mL. Sau đó lấy mẫu 1 mẫu để kiểm tra dầu mỡ khống và COD ngay; 18 mẫu cịn lại đƣợc chia thành 3 nhóm tƣơng ứng với 3 khoảng nhiệt độ khảo sát, đánh số thứ tự 1 – 6 cho mỗi nhóm, tiến hành ni cấy ở vận tốc lắc 50 vòng/phút. Xác định dầu mỡ khoáng, COD và mật độ tế bào sau 1, 3, 5, 7, 9, 12 ngày nuôi cấy thu đƣợc kết quả nhƣ trong hình ảnh 3.9, 3.10 và 3.11 dƣới đây
Hình 3.9: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên q trình xử lý dầu mỡ khống Bảng 3.7: Hiệu quả xử lý dầu mỡ khoáng ở nhiệt độ xử lý khác nhau
Ký hiệu Thời gian (ngày) 300C 370C 450C 0 0.0 0.0 0.0 1 10.8 4.1 1.5 3 42.9 12.6 2.8 5 52.7 28.0 5.9 7 58.8 47.8 9.5 9 73.9 53.0 13.5 12 81.3 55.6 14.8
Từ kết quả khảo sát cho thấy: ở 300C hiệu quả xử lý dầu mỡ khoáng đạt hiệu xử