Nấm Phytopthora là một trong những loài nấm gây hại quan trọng trên cây ăn quả có múi Các lồi nấm P nicotianae, P citrophthora, P palmivora được xác định là các tác nhân chính gây bệnh thối rễ, chảy gơm, thối quả trên cây ăn quả có múi và đã được nghiên cứu tồn diện về vị trí phân loại, đặc điểm sinh học và các biện pháp phòng trừ tại các vùng sản xuất cây ăn quả có múi trên thế giới
Ở Việt Nam nấm Phytophthora gây hại trên cây ăn quả có múi đã được phát hiện từ những năm 1950 tại đồng bằng sông Cửu Long nhưng cho đến nay những nghiên cứu
về bệnh Phytophthora trên cây ăn quả có múi ở Việt Nam cịn rời rạc không liên tục và thường chỉ hạn chế ở mức điều tra tỷ lệ bệnh Chưa có nghiên cứu phát triển chiến lược quản lý bệnh, quản lý vườn ươm, tạo giống kháng bệnh tại các vùng sản xuất cây ăn quả có múi Đặc biệt tại Cao Bằng chưa có những nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh và biện pháp quản lý bệnh thối rễ, chảy gôm thối quả trên các cây cam, quýt, bưởi đặc sản
Việc nghiên cứu sử dụng các vi sinh vật đối kháng, để sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh Phytophthora trên các cây trồng chính ở nước ta đã có những kết quả ban đầu nhưng chỉ là những thử nghiệm trong phịng thí nghiệm hay trên vườn cây diện tích nhỏ chưa đáp ứng được với yêu câu của sản xuất
Điều kiện đất đai, khí hậu của Cao Bằng phù hợp cho cây ăn quả có múi phát triển Cây ăn quả có múi đã và đang đem lại hiệu quả kinh tế cao cho người dân tại Cao Bằng Mặc dù vậy việc sản xuất cây ăn quả có múi ở Cao Bằng mới đang ở những bước ban đầu chưa có những nghiên cứu hệ thống để bảo vệ và phát triển sản xuất cây ăn quả có múi
Hướng nghiên cứu xác định các loài nấm Phytopthora hại cây ăn quả có múi và sử dụng các chế phẩm sinh học quản lý bệnh tại Cao Bằng là một điều cần thiết để đáp ứng được nhu cầu phát triển vùng cây ăn quả có múi đặc sản của Cao Bằng
CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1 Đối tượng nghiên cứu
Các loài nấm Phytophthora gây bệnh trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng Một số vi sinh vật đối kháng với nấm Phytophthora
Các giống cây ăn quả có múi tại Cao Bằng (Cam Trưng Vương, Quýt Hà Trì, Quýt Trà Lĩnh và bưởi Phục Hịa)
2 2 Nợi dung nghiên cứu
2 2 1 Điều tra hiện trạng bệnh do nấm Phytophthora spp gây hại trên cây ăn quả cómúi tại Cao Bằng múi tại Cao Bằng
Điều tra hiện trạng sản xuất CĂQCM và bệnh thối rễ, chảy gôm ở Cao Bằng Thu thập, phân lập, xác định nấm Phytophthora gây bệnh thối rễ, chảy gôm trên CĂQCM ở Cao Bằng
2 2 2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học, quy luật phát sinh gây hại của nấm Phytophthora
spp gây hại trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng
Xác định các loài nấm Phytopthora gây bệnh thối rễ, chảy gơm trên CĂQCM bằng đặc điểm hình thái và kỹ thuật phân tử
Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, nhiệt độ, pH, đến sinh trưởng của nấm các loài nấm Phytophthora gây bệnh trên CĂQCM tại Cao Bằng
Nghiên cứu quy luật phát sinh, gây hại của nấm Phytophthora trên CĂQCM tại Cao Bằng
2 2 3 Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora spp gây bệnh thối rễ, chảy gơm trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng
Thu thập, phân lập, tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng đối kháng cao với các loài nấm Phytophthora gây hại trên cây có múi
Định danh các vi sinh vật đối kháng và xác định mức độ an toàn sinh học
Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển và khả năng nuôi nhân sinh khối và phát triển sản phẩm của các nguồn VSV đối kháng có triển vọng
2 2 4 Đánh giá khả năng sử dụng vi sinh vật đối kháng phòng trừ bệnh Phytophthora trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng trong hệ thống quản lý tổng hợp cây trồng
Nghiên cứu khả năng hạn chế bệnh thối rễ, chảy gôm của các biện pháp canh tác (giống, đốn tỉa, bón phân, tưới nước…) và vi sinh vật đối kháng
Nghiên cứu khả năng hạn chế bệnh thối rễ chảy gôm của các thuốc trừ nấm sinh học và vi sinh vật đối kháng
Nghiên cứu khả năng hạn chế bệnh thối rễ chảy gơm của các thuốc trừ nấm hóa học và vi sinh vật đối kháng
Đề xuất quy trình sử dụng vi sinh vật đối kháng trong quản lý tổng hợp bệnh do nấm Phytophthora spp gây hại trên CĂQCM tại Cao Bằng
2 3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2 3 1 Địa điểm nghiên cứu
Các vùng trồng cây ăn quả có múi của Cao Bằng
Nhà lưới, Phịng thí nghiệm Bộ mơn Bệnh cây và Miễn dịch Thực vật - Viện Bảo vệ thực vật
2 3 2 Thời gian nghiên cứu
Từ năm 2014 – 2020
2 4 Vật liệu nghiên cứu
- Các nguồn nấm Phytophthora phân lập trên cây ăn quả có múi (cam, bưởi, quýt) tại Cao Bằng
- Các nguồn vi sinh vật đối kháng (Tichoderma spp , Bacillus app , Streptomyces spp )
+ Môi trường: PDA, PSA, PCA, PGA, CMA, CRA, PSM - Phytophthora
Selective, Medium); Môi trường Hugh& Leifson, Môi trường LB – vi khuẩn, mơi trường Gauze – xạ khuẩn
Hóa chất sử dụng trong phương pháp PCR: Các Cặp mồi ITS4 và ITS5; Cặp mồi Phy1F và Phy1R
Các chế phẩm sinh học SH-BV1, Phyto-M của Viện Bảo vệ thực vật Các thuốc trừ nấm hóa học
- Máy PCR, máy điện di, kính hiển vi quang học, kính lúp soi nổi, máy đo pH, tủ sấy, nồi hấp, các dụng cụ và vật liệu thí nghiệm, cần thiết khác
2 5 Phương pháp nghiên cứu
2 5 1 Phương pháp điều tra, thu thập mẫu:
Điều tra thu thâp mẫu bênh thối rễ, chảy gôm, thối quả tại vùng sản xuất cây có múi ở các huyện Hịa An, Trà Lĩnh, Thạch An, Ngun Bình và Phục Hòa theo theo phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật, 1997, Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia (QCVN 01 - 119: 2012/BNNPTNT)
Chọn tuyến điều tra đại diện cho các tuổi cây trên giống, điều kiện canh tác khác nhau
Mẫu đất và mẫu rễ được thu thập tại các cây bị bệnh ở độ sâu 20 cm, gạt bỏ khoảng 5-7 cm lớp đất mặt để thu mẫu Mỗi cây thu 4 điểm tại 4 hướng theo hình chiếu tán của cây, cách mép khoảng 30-50 cm, và được trộn đều
Thu thập mẫu, thân, quả bị bênh, ghi rõ ngày tháng, tên giống, bảo quản trong túi polyethylen, lưu giữ trong phịng thí nghiệm
2 5 2 Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh theo chu trình Koch kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử để xác định tên nấm
2 5 2 1 Phân lập nấm Phytophthora:
- Phân lập nấm từ mẫu bệnh: Mẫu bệnh được rửa dưới vòi nước chảy, để khơ trong phịng thí nghiệm Cắt mẫu thành các miếng nhỏ 5 x 5 mm (bao gồm cả mô bệnh và mơ khỏe), Ngâm trong nước javen 2 phút, sau đó rửa bằng cồn 70° trong 1 phút, rửa sạch bằng nước cất vô trùng, làm khô bằng giấy thấm vô trùng rồi đặt vào môi trường PSM Khi tản nấm đã phát triển với kích thước 1 – 2 cm, lấy phần đầu sợi nấm cấy truyền sang môi trường PDA
Theo dõi sự phát triển của tản nấm, thời gian hình thành bọc bào tử, mơ tả hình thái bọc bào tử, sợi nấm
- Phân lập nấm từ mẫu đất: Sử dụng phương pháp mồi bẫy cánh hoa hồng của Erwin & Ribeiro, 1996
+ Cho đất vào 1/3 cốc, thêm nước cất vô trùng vào tới khi đạt 3/4 cốc chiều cao Khuấy nhẹ đất trong cốc bằng đũa thuỷ tinh, để lắng trong 2 giờ (tốt nhất để qua đêm)
+ Cắt cánh hoa hồng có kích thước 0,5 x 0,5 cm (1 mồi bẫy) và thả nhẹ vào cốc nước làm mồi bẫy, để cốc qua đêm ở nhiệt độ 20-25°C
+ Sau 1, 2 và 3 ngày, khi cánh hoa bị mất màu, quan sát bào tử nang của nấm
Phytophthora dưới kính hiển vi
+ Phân lập và làm thuần nấm như phương pháp phân lập từ mẫu mô cây bị bệnh
2 5 2 2 Phương pháp lây bệnh nhân tạo * Lây bệnh nhân tạo trên quả:
Quả cam Trưng Vương chín sinh lý được dùng để lây bệnh Quả được khử trùng bề mặt bằng NaClO 1%, sau đó rửa lại bằng nước cất vơ trùng, làm khơ bằng giấy thấm vơ trùng
Dung dịch nấm có mật độ 2 x 105 cfu/ml, nhúng miếng vải màn kích thước 1x1cm vào dung dịch nấm áp lên bề mặt quả, 1 miếng/quả Dùng băng dính đính miếng vải trên bề mặt vỏ Quả đối chứng sử dụng nước cất vô trùng Các quả đã lây nhiễm và đối chứng được đặt trong điều kiện ẩm độ, nhiệt độ 25-280C, trong bóng tối hồn tồn từ 5 đến 7 ngày Quan sát hàng ngày và ghi nhận, mô tả sự phát triển của bệnh
* Lây bệnh trên cây con:
Lây bệnh cho cây con bằng cách lây trên thân cây và tưới vào gốc cây Cây cam Trưng Vương 12 tháng tuổi ghép trên gốc chấp được trồng trong chậu chứa hỗn hợp đất phù sa, mùn và trấu khử trùng đặt ở nhiệt độ 25-280C, nấm được nhân nuôi trên môi trường PDA Thân cây được khử trùng bằng cồn 700, lật phần vỏ cây đường kính 5mm, áp miếng thạch có chứa nấm 5 ngày tuổi áp lại miếng vỏ (Alvarez và cs 2008) Nhỏ 1 giọt nước cất vơ trùng và quấn kín bằng giấy parafilm, bao bằng giấy thiếc để hạn chế sự thoát hơi nước của miếng thạch Dung dịch nấm Phytophthora được tưới vào các cây thí nghiệm, chăm sóc và tưới ẩm hàng ngày bằng máy phun sương Cây đối chứng sử dụng miếng thạch (PDA) khơng có nấm
Thí nghiệm được thực hiện với 10 mẫu nấm mỗi mẫu lây bệnh cho 10 cây Quan sát, ghi nhận và mô tả vết bệnh sau 30 ngày lây nhiễm
- Phân lập nấm từ các cây lây bệnh
Quả và cây sau khi xuất hiện vết bệnh sẽ được mô tả triệu chứng, tái phân lập nấm So sánh triệu chứng của cây bị bệnh tự nhiên và cây lây bệnh nhân tạo, hình thái nấm từ vết bệnh ngoài tự nhiên và mẫu nấm qua lây bệnh nhân tạo
2 5 2 3 Phương pháp xác định loài nấm Phytophthora
- Xác định loài Phytophthora dựa vào đặc điểm hình thái học
Việc xác định lồi Phytophthora dựa vào hình thái của bọc bào tử (sporang), núm (papilla), các cấu trúc sinh sản hữu tính như bao đực, bao trứng, bào tử trứng (oospore) theo khóa phân loại của Drenth, Sendall (2001), Erwin và Ribeiro (1996)
- Xác định loài Phyophthora bằng phương pháp PCR + PCR và giải trình tự
Mẫu nấm được nhân nuôi trên môi trường PDA (2 3 1 1) trong 5 ngày DNA được tách chiết từ các mẫu nấm đã nuôi cấy trên môi trường theo phương pháp CTAB
(Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987) Lấy 0,1 g đến 0,2 g sinh khối nấm vào ống eppendorf dung tích 1,5ml có chứa 700 µl dung dịch đệm CTAB 2% (0,1 M Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA, 2% CTAB, 100µg protease K, bổ sung 0,4% β- mecaptoethanol trước khi sử dụng) Ủ dịch ở 65°C trong 45 phút, lắc nhẹ bằng cách đảo ngược sau mỗi 15 phút Cho 500 µl Clorofom : Isoamyl alcohol (24:1) vào ống và lắc nhẹ trong 1 phút Ly tâm ở 12000 vịng/phút trong 10 phút và lấy 600 µl phần dịch nổi
chuyển sang ống eppendorf mới Bổ sung 500 µl Clorofom : Isoamyl alcohol (24:1) Lặp lại bước này 2 lần Lấy 500 µl phần dịch nổi chuyển sang ống mới có chứa 700 µl isopropanol lạnh (- 200C); Lắc nhẹ ống bằng cách đảo ngược và ly tâm ở 12000
vòng/phút trong 10 phút Loại bỏ phần chất lỏng bên trên, rửa kết tủa DNA bằng 700 µl ethanol 70% Làm khô cặn DNA trong 30 phút và hịa cặn DNA với 100 µl đệm TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0) và bổ sung 5 µl ribonuclease (RNAse 10 mg/ml) vào mỗi ống; đặt các ống trong tủ định ôn ở nhiệt độ 370C trong 1 h, sau đó lưu giữ ở nhiệt độ -200C
Phản ứng PCR Hai mồi ITS4 và ITS5 (White và cs , 1990) đã được sử dụng để nhân
ITS4: 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ ITS5: 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’
Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq Polymerase của hãng Fermentas với nhiệt độ gắn mồi ở 52°C Phản ứng PCR được thiết lập với tổng thể tích 25 µl với các thành phần: 2 µl DNA (xấp xỉ 1-100 ng), 2,5 µl 10X Taq Buffer, 2,5 µl dNTP (200 µM), 1 µl cho mỗi primer (10 µM), 2,5 µl Mg2+ (25 mM), 0,1 µl Taq (5 units/µl) và nước cất 2 lần Phản ứng khuếch đại PCR với chu trình gia nhiệt như sau: phá vỡ cấu trúc DNA ban đầu ở nhiệt độ 940C trong 4 phút, 35 vòng khuếch đại cấu trúc ở nhiệt độ 940C trong 1 phút, ủ ở nhiệt độ 540C trong 1 phút, 720C trong 1,5 phút, sau 35 vòng, ủ thêm mẫu ở nhiệt độ 720C trong 10 phút, duy trì nhiệt độ ở 40C Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Hàm lượng DNA được ước lượng nồng độ bằng điện di agarose Sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp 1 chiều dùng mồi PCR tại Viện Công nghệ sinh học tại Hà Nội Trình tự nucleotide được biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene)
+ Phân tích trình tự: Dựa trên các trình tự thu được, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information) ( http://www ncbi nlm nih gov/BLAST/ )
Các trình tự được căn trình tư đa chuỗi bằng phần mềm Clustal X ver 2 0 (Larkin và cs , 2007) Cây phả hệ được phân tích bằng phần mềm MEGA X (Kumar và cs , 2018)
2 5 3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm Phytophthora
2 5 3 1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm Phytophthora
- Nấm được nhân nuôi trên môi trường PDA, CRA và V8A trong điều kiện 250C Quan sát màu sắc tản nấm, hình dạng, kích thước bào tử túi Đo kích thước bào tử túi trên kính hiển vi quang học (OLYMPUS CX41)
2 5 3 2 Nghiên cứu các dặc điểm sinh học, sinh thái của nấm Phytophthora a Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Phytophthora
Cấy miếng thạch có nấm 5 mm vào chính giữa các hộp petri có chứa các mơi trường PDA, PCA, CMA, CRA, PSA và V8A Thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần 3 đĩa petri, các hộp ptri được để ở nhiệt độ 250C
Chỉ tiêu theo dõi: đường kính tản nấm sau 2,4 và 6 ngày sau nuôi cấy
b Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Phytophthora
Khoanh nấm được ni cấy trong đĩa petri có chứa mơi trường PDA ở điều kiện tối hoàn toàn ở các nhiệt độ 5, 10,15, 20, 25, 30, 35 và 400C Thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần 3 đĩa petri
Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm sau 2,4 và 6 ngày sau ni cấy
c Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh bọc bào tử của nấm Phytophthora
Nấm được nhân nuôi trên môi trường V8A ở nhiệt độ 250C Sau 24h rửa tản nấm bằng nước cất khử trùng 3 lần và được đặt ở nhiệt độ 10,15,20,25,30 và 350C Sau 48h, chuyển nấm vào ống nghiệm, cho thêm 10 ml nước cất, lắc đều trong 30 giây và đếm số lượng bọc bào tử bằng buồng đếm hồng cầu Mỗi công thức nhắc lại 3 lần mỗi lần 3 đĩa
d Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Phytophthora
Thí nghiệm được thực hiện trên mơi trường PDA ở 9 mức pH từ 4, đến 8 với khoảng cách 0,5 Điều chỉnh pH trên môi trường bằng 0,1M NaOH hoặc 0,1M HCl Sau khi cấy truyền khoanh nấm, các đĩa petri được đặt trong tủ định ôn ở nhiệt độ 250C trong điều kiện 12h tối/12h sáng Thí nghiệm bao gồm 9 cơng thức (các mức pH), Mỗi công thức nhắc lại 3 lần mỗi lần 3 đĩa
Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm sau 2,4 và 6 ngày sau nuôi cấy
2 5 4 Nghiên cứu quy luật phát sinh gây bệnh thối rễ chảy gơm do nấm Phytophthoratrên cây ăn quả có múi trên cây ăn quả có múi
2 5 4 1 Nghiên cứu diễn biến phát sinh phát triển của bệnh thối rễ chảy gôm