3 1 Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora
332 Xác định các vi sinh vật đối kháng và mức độ an toàn sinh học
Các nguồn vi sinh vật đối kháng có hoạt tính cao BHA12 2, BNB 3 8 và STL2 7 đã được định danh bằng phương pháp truyền thống thông qua đặc điểm tế bào, khuẩn lạc và các phản ứng sinh hóa theo tài liệu của Bergey và phương pháp sinh học phân tử
Phương pháp PCR sử dụng cặp mồi Phy1F và Phy1R (Hà Viết Cường và cộng sự, 2010)
3 3 2 1 Định danh các vi sinh vật đối kháng theo đặc điểm sinh hóa hoc
Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học của 03 nguồn VSV đối kháng BHA12 2, STL2 7 và BNB 3 8 được tổng hợp trong bảng 3 26 Dựa vào hình thái khuẩn lạc, hình thái
thế bào, phản ứng Gram và nhu cầu sử dụng oxy các mẫu BHA12 2, và BNB 3 8 được xác định là các vi khuẩn hiếu khí, sinh bào tử, mẫu STL2 7 là xạ khuẩn
Kết quả cho thấy, 3 nguồn vi sinh vật BHA12 2, BNB 3 8 và STL2 7 đều có khả năng đồng hóa các nguồn cac bon D-glucose, Saccarose, tinh bột, Xenlulose, Glycerol và Maltose màu sắc môi trường chuyển từ màu xanh (màu của đối chứng) sang màu da cam và vàng nhạt
Bảng 3 26 Một số Đặc điểm sinh học của các ngn vi sinh vật có triển vọng (Năm 2017)
TT Nguôn
VSV Hình thái khuẩn lạc, tế bào
Phản ứng Gram
Nhu cầu O2
Trên môi trường King’s B khuẩn lạc tròn
1 BHA12 2 màu trắng đục, mép khuẩn lạc nhăn, tế bào + + hình gậy, sinh bào tử
Trên môi trường YS khuẩn lạc màu màu
2 STL2 7 nâu xám, bào tử hình bầu dục, chuỗi bào tử + + đơn hoặc phân nhánh dạng xoắn
Trên môi trường PDA khuẩn lạc trịn, có
3 BNB3 8 màu trắng đục, bề mặt khuẩn lạc nhăn, tế + + bào hình gậy, sinh bào tử
Bảng 3 27 Khả năng đơng hóa ngn Các bon của các ngn vi sinh vật đối kháng (Năm 2017)
TT Mẫu VSV D-
glucose Saccarose
Tinh
bột Xenlulose Glycerol Maltose
1 2 3 BHA12 2 BNB3 8 STL2 7 ++ ++ + + + ++ ++ ++ + ++ + + + + ++ + + ++ Các kết quả nghiên cứu hình thái khuẩn lạc, tế bào, nhuộm Gram khả năng sử dụng oxy và các nguồn các bon đã xác định đươc 2 mẫu VSV BHA12 2 và BNB3 8 thuộc giống
3 3 2 2 Định danh các vi sinh vật đối kháng bằng phương pháp PCR
Cặp mồi Phy1F và Phy1R đã được Sử dụng để xác định các nguồn BHA12 2, BNB 3 8 và STL2 7
Trình tự gen của 03 nguồn BHA12 2, STL2 7, BNB3 8 đã được so sánh so sánh với các nguồn gen trên ngân hàng gen quốc tế Trình tự gen của nguồn BHA12 2 tương đồng 99,62% với loài Bacillus amyloliquefaciens được đăng ký với mã số Genbank FN597644, mẫu BNB3 8 tương đồng 99,72 với loài Bacillus methylotrophicus được đăng ký với mã số Genbank AB184285 và nguồn STL2 7 tương đồng 100% với loài
Streptomyces misionensis được đăng ký với mã số Genbank AB184285
Bảng 3 28 Kết quả định danh các chủng VSV đối kháng nấm Phytophthora gây bệnh trên cây ăn quả có múi (Năm 2017)
Kích thước Phần Mẫu VSV Mã trình tự sản phẩm sau khi lắp trăm đơng nhất Mã GenBank Lồi ráp (bp) trình tự
BHA12 2 13B5ZAA012 1321 99,62 FN597644 Bacillus
13B5ZAA013 amyloliquefaciens
BNB3 8 13B5ZAA004 1436 99,72 AB184285 Bacillus
13B5ZAA005 methylotrophicus
STL2 7 13B5ZAA024 1421 100 AB184285 Streptomyces
13B5ZAA025 misionensis
Kết quả của các phản ứng sinh hóa và kỹ thuật sinh học phân tử đã xác định nguồn BHA12 2 thuộc về vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens, nguồn BNB 3 8 thuộc về vi khuẩn
Bacillus methylotrophicus và nguồn STL2 7 thuộc về xạ khuẩn Streptomyces misionensis 3 3 2 3 Xác định mức độ an toàn sinh học của các loài vi khuẩn Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus methylotrophicus và xạ khuẩn Streptomyces misionensis
Theo Cộng đồng châu Âu các nhóm tác nhân sinh học, gồm vi khuẩn, vi rút, nấm, ký sinh trùng được phân làm 4 cấp độ an toàn Mức độ an toàn của các tác nhân sinh học cụ thể như sau (TRBA 460, 466; 2015, 2016):
- Tác nhân sinh học có mức an tồn sinh học 1 là các tác nhân sinh học khơng có nguy hiểm đối với sức khỏe người, động vật và mơi trường sinh thái
- Tác nhân sinh học có mức an tồn sinh học 2 là các tác nhân sinh học có nguy hiểm tiềm tàng đối với sức khỏe người, động vật và môi trường sinh thái ở mức độ thấp và hồn tồn có thể khống chế được bằng các các biện pháp quản lý an toàn
- Tác nhân sinh học có mức an tồn sinh học 3 là các tác nhân sinh học gây tác động có hại ở mức độ trung bình đối với sức khỏe người, động vật và môi trường sinh thái Các tác động gây ra về cơ bản có thể phịng tránh được bằng các các biện pháp quản lý an toàn
- Tác nhân sinh học có mức an tồn sinh học 4 là các tác nhân sinh học gây tác động có hại ở mức độ cao đối với sức khỏe người, động vật và môi trường sinh thái Các tác động gây ra ngồi phạm vi giới hạn, hiện khơng có biện pháp phịng tránh
Chỉ các sinh vật có mức an toàn ở cấp độ 1 và 2 mới được ứng dụng trong sản xuất ở điều kiện bình thường
Bảng 3 29 Mức đợ an tồn sinh học của các vi sinh vật đối kháng (Năm 2017)
TT Tên khoa học Thơng tin ngn mẫu
Cây trơng Vị trí Địa Điểm
Cấp đợ an tồn sinh học
1 Bacillus amyloliquefaciens Cam Đất Hòa An 1
(BHA12 2)
2 Bacillus methylotrophicus Quýt Đất Trà Lĩnh 1
(BNB3 8)
3 Streptomyces misionensis Quýt Đất Trà Lĩnh 1
(STL2 7)
So với danh mục các vi khuẩn, vi nấm đã được phân cấp mức an toàn sinh học của Cộng đồng Châu Âu nêu trên, 3 loài vi sinh vật đối kháng Bacillus amyloliquefaciens,
Bacillus methylotrophicus và Streptomyces misionensis được xác định thuộc nhóm tác
nhân sinh học có mức an tồn 1, là mức được ứng dụng trong sản xuất ở điều kiện bình thường (bảng 3 29)
Bacillus là vi khu ẩ n có khả năng tạ o bào t ử và s ống sót trong các điề u ki ệ n khó
khăn, được khai tác sử dụng là probiotic cho người, vật nuôi, động vật thủy sản và làm thuốc bảo vệ thực vật sinh học (Yu và cs, 2002; Jang và cs, 2006; Chung và cs, 2008; Shaligram and Singhal, 2010; Mardanova và cs, 2017; Keswani, 2019) Tại Việt Nam,
Cường và cộng tác viên, 2003; Vũ Thúy Nga, 2008; Lê Như Kiểu và cộng tác viên, 2011; Nguyen và cs, 2019; Thi Phuong Hanh Tran và cs, 2019; T H T Trinh và cs, 2019)
Xạ khuẩn Streptomyces đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong sản xuất từ nhiều chục năm nay Theo Watve và cs, (2001) khoảng 7 600/43 000 các hoạt chất sinh học, 100 000 chất kháng sinh đang được sử dụng trong y dược và nông nghiệp được sản xuất từ Streptomyces
Tại Việt Nam đã có một số cơng trình nghiên cứu ứng dụng xạ khuẩn kiểm sốt bệnh khô vằn, đạo ôn trên lúa, bệnh thối thân trên hoa sen và bệnh trên cây cà chua (Lê Minh Tường và Ngô Thị Kim Ngân (2014), (Nguyễn Thị Phong Lan và cộng tác viên, 2015), (Đinh Hồng Thái và Lê Minh Tường, 2016), (Nguyễn Thị Kim Cúc, 2014)