spp gây hại trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng
Xác định các loài nấm Phytopthora gây bệnh thối rễ, chảy gơm trên CĂQCM bằng đặc điểm hình thái và kỹ thuật phân tử
Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, nhiệt độ, pH, đến sinh trưởng của nấm các loài nấm Phytophthora gây bệnh trên CĂQCM tại Cao Bằng
Nghiên cứu quy luật phát sinh, gây hại của nấm Phytophthora trên CĂQCM tại Cao Bằng
2 2 3 Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora spp gây bệnh thối rễ, chảy gơm trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng
Thu thập, phân lập, tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng đối kháng cao với các lồi nấm Phytophthora gây hại trên cây có múi
Định danh các vi sinh vật đối kháng và xác định mức độ an toàn sinh học
Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển và khả năng nuôi nhân sinh khối và phát triển sản phẩm của các nguồn VSV đối kháng có triển vọng
2 2 4 Đánh giá khả năng sử dụng vi sinh vật đối kháng phịng trừ bệnh Phytophthora trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng trong hệ thống quản lý tổng hợp cây trồng
Nghiên cứu khả năng hạn chế bệnh thối rễ, chảy gơm của các biện pháp canh tác (giống, đốn tỉa, bón phân, tưới nước…) và vi sinh vật đối kháng
Nghiên cứu khả năng hạn chế bệnh thối rễ chảy gôm của các thuốc trừ nấm sinh học và vi sinh vật đối kháng
Nghiên cứu khả năng hạn chế bệnh thối rễ chảy gơm của các thuốc trừ nấm hóa học và vi sinh vật đối kháng
Đề xuất quy trình sử dụng vi sinh vật đối kháng trong quản lý tổng hợp bệnh do nấm Phytophthora spp gây hại trên CĂQCM tại Cao Bằng
2 3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2 3 1 Địa điểm nghiên cứu
Các vùng trồng cây ăn quả có múi của Cao Bằng
Nhà lưới, Phịng thí nghiệm Bộ mơn Bệnh cây và Miễn dịch Thực vật - Viện Bảo vệ thực vật
2 3 2 Thời gian nghiên cứu
Từ năm 2014 – 2020
2 4 Vật liệu nghiên cứu
- Các nguồn nấm Phytophthora phân lập trên cây ăn quả có múi (cam, bưởi, quýt) tại Cao Bằng
- Các nguồn vi sinh vật đối kháng (Tichoderma spp , Bacillus app , Streptomyces spp )
+ Môi trường: PDA, PSA, PCA, PGA, CMA, CRA, PSM - Phytophthora
Selective, Medium); Môi trường Hugh& Leifson, Môi trường LB – vi khuẩn, mơi trường Gauze – xạ khuẩn
Hóa chất sử dụng trong phương pháp PCR: Các Cặp mồi ITS4 và ITS5; Cặp mồi Phy1F và Phy1R
Các chế phẩm sinh học SH-BV1, Phyto-M của Viện Bảo vệ thực vật Các thuốc trừ nấm hóa học
- Máy PCR, máy điện di, kính hiển vi quang học, kính lúp soi nổi, máy đo pH, tủ sấy, nồi hấp, các dụng cụ và vật liệu thí nghiệm, cần thiết khác
2 5 Phương pháp nghiên cứu
2 5 1 Phương pháp điều tra, thu thập mẫu:
Điều tra thu thâp mẫu bênh thối rễ, chảy gơm, thối quả tại vùng sản xuất cây có múi ở các huyện Hịa An, Trà Lĩnh, Thạch An, Ngun Bình và Phục Hòa theo theo phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật, 1997, Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia (QCVN 01 - 119: 2012/BNNPTNT)
Chọn tuyến điều tra đại diện cho các tuổi cây trên giống, điều kiện canh tác khác nhau
Mẫu đất và mẫu rễ được thu thập tại các cây bị bệnh ở độ sâu 20 cm, gạt bỏ khoảng 5-7 cm lớp đất mặt để thu mẫu Mỗi cây thu 4 điểm tại 4 hướng theo hình chiếu tán của cây, cách mép khoảng 30-50 cm, và được trộn đều
Thu thập mẫu, thân, quả bị bênh, ghi rõ ngày tháng, tên giống, bảo quản trong túi polyethylen, lưu giữ trong phịng thí nghiệm
2 5 2 Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh theo chu trình Koch kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử để xác định tên nấm
2 5 2 1 Phân lập nấm Phytophthora:
- Phân lập nấm từ mẫu bệnh: Mẫu bệnh được rửa dưới vòi nước chảy, để khơ trong phịng thí nghiệm Cắt mẫu thành các miếng nhỏ 5 x 5 mm (bao gồm cả mô bệnh và mô khỏe), Ngâm trong nước javen 2 phút, sau đó rửa bằng cồn 70° trong 1 phút, rửa sạch bằng nước cất vô trùng, làm khô bằng giấy thấm vô trùng rồi đặt vào môi trường PSM Khi tản nấm đã phát triển với kích thước 1 – 2 cm, lấy phần đầu sợi nấm cấy truyền sang môi trường PDA
Theo dõi sự phát triển của tản nấm, thời gian hình thành bọc bào tử, mơ tả hình thái bọc bào tử, sợi nấm
- Phân lập nấm từ mẫu đất: Sử dụng phương pháp mồi bẫy cánh hoa hồng của Erwin & Ribeiro, 1996
+ Cho đất vào 1/3 cốc, thêm nước cất vô trùng vào tới khi đạt 3/4 cốc chiều cao Khuấy nhẹ đất trong cốc bằng đũa thuỷ tinh, để lắng trong 2 giờ (tốt nhất để qua đêm)
+ Cắt cánh hoa hồng có kích thước 0,5 x 0,5 cm (1 mồi bẫy) và thả nhẹ vào cốc nước làm mồi bẫy, để cốc qua đêm ở nhiệt độ 20-25°C
+ Sau 1, 2 và 3 ngày, khi cánh hoa bị mất màu, quan sát bào tử nang của nấm
Phytophthora dưới kính hiển vi
+ Phân lập và làm thuần nấm như phương pháp phân lập từ mẫu mô cây bị bệnh
2 5 2 2 Phương pháp lây bệnh nhân tạo * Lây bệnh nhân tạo trên quả:
Quả cam Trưng Vương chín sinh lý được dùng để lây bệnh Quả được khử trùng bề mặt bằng NaClO 1%, sau đó rửa lại bằng nước cất vơ trùng, làm khô bằng giấy thấm vô trùng
Dung dịch nấm có mật độ 2 x 105 cfu/ml, nhúng miếng vải màn kích thước 1x1cm vào dung dịch nấm áp lên bề mặt quả, 1 miếng/quả Dùng băng dính đính miếng vải trên bề mặt vỏ Quả đối chứng sử dụng nước cất vô trùng Các quả đã lây nhiễm và đối chứng được đặt trong điều kiện ẩm độ, nhiệt độ 25-280C, trong bóng tối hồn tồn từ 5 đến 7 ngày Quan sát hàng ngày và ghi nhận, mô tả sự phát triển của bệnh
* Lây bệnh trên cây con:
Lây bệnh cho cây con bằng cách lây trên thân cây và tưới vào gốc cây Cây cam Trưng Vương 12 tháng tuổi ghép trên gốc chấp được trồng trong chậu chứa hỗn hợp đất phù sa, mùn và trấu khử trùng đặt ở nhiệt độ 25-280C, nấm được nhân nuôi trên môi trường PDA Thân cây được khử trùng bằng cồn 700, lật phần vỏ cây đường kính 5mm, áp miếng thạch có chứa nấm 5 ngày tuổi áp lại miếng vỏ (Alvarez và cs 2008) Nhỏ 1 giọt nước cất vơ trùng và quấn kín bằng giấy parafilm, bao bằng giấy thiếc để hạn chế sự thoát hơi nước của miếng thạch Dung dịch nấm Phytophthora được tưới vào các cây thí nghiệm, chăm sóc và tưới ẩm hàng ngày bằng máy phun sương Cây đối chứng sử dụng miếng thạch (PDA) khơng có nấm
Thí nghiệm được thực hiện với 10 mẫu nấm mỗi mẫu lây bệnh cho 10 cây Quan sát, ghi nhận và mô tả vết bệnh sau 30 ngày lây nhiễm
- Phân lập nấm từ các cây lây bệnh
Quả và cây sau khi xuất hiện vết bệnh sẽ được mô tả triệu chứng, tái phân lập nấm So sánh triệu chứng của cây bị bệnh tự nhiên và cây lây bệnh nhân tạo, hình thái nấm từ vết bệnh ngoài tự nhiên và mẫu nấm qua lây bệnh nhân tạo
2 5 2 3 Phương pháp xác định loài nấm Phytophthora
- Xác định loài Phytophthora dựa vào đặc điểm hình thái học
Việc xác định lồi Phytophthora dựa vào hình thái của bọc bào tử (sporang), núm (papilla), các cấu trúc sinh sản hữu tính như bao đực, bao trứng, bào tử trứng (oospore) theo khóa phân loại của Drenth, Sendall (2001), Erwin và Ribeiro (1996)
- Xác định loài Phyophthora bằng phương pháp PCR + PCR và giải trình tự
Mẫu nấm được nhân ni trên mơi trường PDA (2 3 1 1) trong 5 ngày DNA được tách chiết từ các mẫu nấm đã nuôi cấy trên môi trường theo phương pháp CTAB
(Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987) Lấy 0,1 g đến 0,2 g sinh khối nấm vào ống eppendorf dung tích 1,5ml có chứa 700 µl dung dịch đệm CTAB 2% (0,1 M Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA, 2% CTAB, 100µg protease K, bổ sung 0,4% β- mecaptoethanol trước khi sử dụng) Ủ dịch ở 65°C trong 45 phút, lắc nhẹ bằng cách đảo ngược sau mỗi 15 phút Cho 500 µl Clorofom : Isoamyl alcohol (24:1) vào ống và lắc nhẹ trong 1 phút Ly tâm ở 12000 vịng/phút trong 10 phút và lấy 600 µl phần dịch nổi
chuyển sang ống eppendorf mới Bổ sung 500 µl Clorofom : Isoamyl alcohol (24:1) Lặp lại bước này 2 lần Lấy 500 µl phần dịch nổi chuyển sang ống mới có chứa 700 µl isopropanol lạnh (- 200C); Lắc nhẹ ống bằng cách đảo ngược và ly tâm ở 12000
vòng/phút trong 10 phút Loại bỏ phần chất lỏng bên trên, rửa kết tủa DNA bằng 700 µl ethanol 70% Làm khơ cặn DNA trong 30 phút và hịa cặn DNA với 100 µl đệm TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0) và bổ sung 5 µl ribonuclease (RNAse 10 mg/ml) vào mỗi ống; đặt các ống trong tủ định ôn ở nhiệt độ 370C trong 1 h, sau đó lưu giữ ở nhiệt độ -200C
Phản ứng PCR Hai mồi ITS4 và ITS5 (White và cs , 1990) đã được sử dụng để nhân
ITS4: 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ ITS5: 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’
Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq Polymerase của hãng Fermentas với nhiệt độ gắn mồi ở 52°C Phản ứng PCR được thiết lập với tổng thể tích 25 µl với các thành phần: 2 µl DNA (xấp xỉ 1-100 ng), 2,5 µl 10X Taq Buffer, 2,5 µl dNTP (200 µM), 1 µl cho mỗi primer (10 µM), 2,5 µl Mg2+ (25 mM), 0,1 µl Taq (5 units/µl) và nước cất 2 lần Phản ứng khuếch đại PCR với chu trình gia nhiệt như sau: phá vỡ cấu trúc DNA ban đầu ở nhiệt độ 940C trong 4 phút, 35 vòng khuếch đại cấu trúc ở nhiệt độ 940C trong 1 phút, ủ ở nhiệt độ 540C trong 1 phút, 720C trong 1,5 phút, sau 35 vòng, ủ thêm mẫu ở nhiệt độ 720C trong 10 phút, duy trì nhiệt độ ở 40C Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Hàm lượng DNA được ước lượng nồng độ bằng điện di agarose Sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp 1 chiều dùng mồi PCR tại Viện Công nghệ sinh học tại Hà Nội Trình tự nucleotide được biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene)
+ Phân tích trình tự: Dựa trên các trình tự thu được, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information) ( http://www ncbi nlm nih gov/BLAST/ )
Các trình tự được căn trình tư đa chuỗi bằng phần mềm Clustal X ver 2 0 (Larkin và cs , 2007) Cây phả hệ được phân tích bằng phần mềm MEGA X (Kumar và cs , 2018)
2 5 3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm Phytophthora
2 5 3 1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm Phytophthora
- Nấm được nhân nuôi trên môi trường PDA, CRA và V8A trong điều kiện 250C Quan sát màu sắc tản nấm, hình dạng, kích thước bào tử túi Đo kích thước bào tử túi trên kính hiển vi quang học (OLYMPUS CX41)
2 5 3 2 Nghiên cứu các dặc điểm sinh học, sinh thái của nấm Phytophthora a Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Phytophthora
Cấy miếng thạch có nấm 5 mm vào chính giữa các hộp petri có chứa các mơi trường PDA, PCA, CMA, CRA, PSA và V8A Thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần 3 đĩa petri, các hộp ptri được để ở nhiệt độ 250C
Chỉ tiêu theo dõi: đường kính tản nấm sau 2,4 và 6 ngày sau nuôi cấy
b Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Phytophthora
Khoanh nấm được ni cấy trong đĩa petri có chứa mơi trường PDA ở điều kiện tối hoàn toàn ở các nhiệt độ 5, 10,15, 20, 25, 30, 35 và 400C Thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần 3 đĩa petri
Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm sau 2,4 và 6 ngày sau nuôi cấy
c Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh bọc bào tử của nấm Phytophthora
Nấm được nhân nuôi trên môi trường V8A ở nhiệt độ 250C Sau 24h rửa tản nấm bằng nước cất khử trùng 3 lần và được đặt ở nhiệt độ 10,15,20,25,30 và 350C Sau 48h, chuyển nấm vào ống nghiệm, cho thêm 10 ml nước cất, lắc đều trong 30 giây và đếm số lượng bọc bào tử bằng buồng đếm hồng cầu Mỗi công thức nhắc lại 3 lần mỗi lần 3 đĩa
d Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Phytophthora
Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường PDA ở 9 mức pH từ 4, đến 8 với khoảng cách 0,5 Điều chỉnh pH trên môi trường bằng 0,1M NaOH hoặc 0,1M HCl Sau khi cấy truyền khoanh nấm, các đĩa petri được đặt trong tủ định ôn ở nhiệt độ 250C trong điều kiện 12h tối/12h sáng Thí nghiệm bao gồm 9 cơng thức (các mức pH), Mỗi công thức nhắc lại 3 lần mỗi lần 3 đĩa
Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm sau 2,4 và 6 ngày sau nuôi cấy
2 5 4 Nghiên cứu quy luật phát sinh gây bệnh thối rễ chảy gơm do nấm Phytophthoratrên cây ăn quả có múi trên cây ăn quả có múi
2 5 4 1 Nghiên cứu diễn biến phát sinh phát triển của bệnh thối rễ chảy gôm
Điều tra: Theo phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật 1997; Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại trên cây ăn quả có múi (QCVN 01 - 119: 2012/BNNPTNT)
Điều tra trên vườn cây 8 tuổi, mỗi huyện điều tra 5 vườn mỗi vườn điều tra 5 điểm theo đường chéo góc, mỗi điểm cố định 3 cây Điều tra định kỳ 15 ngày/lần
Phương pháp phân cấp bệnh trên thân (Theo Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 579: 2003) Cấp 1: Cấp 3: Cấp 5: Cấp 7: Cấp 9: Có 1 vết bệnh trên thân (cành)
Có 2 vết bệnh trên thân (cành) hoặc có 1 vết bệnh thân (cành) với chiều rộng của vết bệnh chiếm <20 % chu vi vịng thân (cành)
Có 3 - 4 vết bệnh trên thân (cành) hoặc 1 vết bệnh trên thân (cành) có chiều rộng chiếm 20 - <50% chu vi vịng thân (cành)
Có 4 -5 vết bệnh trên thân (cành) hoặc 1 vết bệnh trên thân (cành) có chiều rộng chiếm từ 50 - <75% chu vi vịng thân (cành)
Có trên 5 vết bệnh trên thân (cành) hoặc 1 vết bệnh trên thân (cành) có chiều rộng chiếm từ 75% chu vi vòng thân (cành) trở lên
Ghi chú: chu vi thân (cành) được đo tại vị trí vết bệnh có chiều rộng lớn nhất
Phương pháp phân cấp bệnh trên lá: (Gade và Kloch 2012, Choudhari và cs 2018) Cấp 0: Lá khơng có màu vàng Cấp 1 Lá biến vàng và lá rụng (1-10%) Cấp 3 Lá biến vàng và lá rụng (11-25%) Cấp 5 Lá biến vàng và lá rụng (26-50%) Cấp 7 Lá biến vàng và rụng > 50% Cấp 9 Cành bị khô
- Chỉ tiêu theo dõi: Mức độ phổ biến, Tỷ lệ bệnh % (TLB %), chỉ số bệnh % (CSB %) Mức độ phổ biến: (+): số cây bị bệnh < 10%; (++): số cây bị bệnh từ >10-25%
(+++): số cây bị bệnh >25-50% ; (++++): số cây bị bệnh >50% Số cây bị bệnh
Tỉ lệ bệnh (%) =
Chỉ số bệnh (%) =
x100 Tổng số cây điều tra
Σ (ni x vi)
x 100 (N x k)
Trong đó: Σ (ni x vi) là tổng tích số lá cây bị bệnh với trị số cấp bệnh tương ứng, k là trị số cấp bệnh cao nhất N là tổng số lá điều tra
2 5 4 2 Tình hình bệnh thối rễ chảy gơm trên các giống cây ăn quả có múi
Điều tra trên các vườn trồng các giống cây ăn quả có múi đang được trồng phổ biến tại Cao Bằng ở giai đoạn cây 8 năm tuổi Mỗi giống chọn 5 vườn, mỗi vườn điều tra theo 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 5 cây
Phương pháp điều tra theo phương pháp điều tra diễn biến phát sinh phát triển của bệnh
Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ bệnh (%) và chỉ số bệnh (%)
2 5 4 3 Tình hình bệnh thối rễ chảy gơm trên cây có múi ở các độ tuổi khác nhau
Điều tra trên các vườn cây có độ tuổi từ 2-3 năm, 5-6 năm, 8-10 năm và trên 10 năm Mỗi tuổi cây chọn 5 vườn, mỗi vườn điều tra theo 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 5 cây
Phương pháp điều tra theo phương pháp điều tra diễn biến phát sinh phát triển của bệnh
Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ bệnh (%) và chỉ số bệnh (%)
2 5 4 4 Nghiên cứu ảnh hưởng của địa hình đến bệnh thối rễ chảy gơm
Điều tra trên các vườn trồng ở khu vực có kiểu địa hình khác nhau Mỗi kiểu địa hình điều tra 3 vườn, mỗi vườn điều tra theo 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 5 cây