2 53 Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm Phytophthora
255 Phân lập, tuyển chọn, định danh vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora
2 5 5 1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng
Mẫu đất được thu thập tại các vườn cây ăn quả có múi khơng bị bệnh thối rễ, chảy gôm hay bị bệnh nhẹ
Gạt bỏ khoảng 5-7 cm lớp đất mặt và đào sâu tới 20cm để thu mẫu Mỗi cây thu 4 điểm tại 4 hướng theo hình chiếu tán của cây, cách mép khoảng 30-50 cm, và được trộn đều
Vi sinh vật đối kháng được phân lập theo phương pháp của Rupela và cs (2003) và được thực hiện như sau: Dùng micropipet đã vô trùng hút 0,1 ml dịch nấm Phytophthora
sẵn; Lắc nhẹ đĩa petri cho dịch nấm gây bệnh tràn đều trên bề mặt thạch, dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dịch nấm gây bệnh thấm hoàn toàn trên bề mặt thạch Chú ý không để dịch nấm gây bệnh dính vào thành đĩa petri; Sau khi bề mặt thạch khô (khoảng 4 h), phủ tiếp khoảng 15 ml đến 20 ml mơi trường thích hợp với vi sinh vật đối kháng (lớp thạch thứ hai) lên lớp thạch thứ nhất đã cấy nấm gây bệnh Các đĩa thạch được để khô trong 45 min; Dùng micropipet đã vô trùng hút 0,1 ml dịch pha lỗng mẫu đất, rễ cây có múi thu thập ở trên, cấy lên bề mặt lớp thạch thứ hai Lắc nhẹ đĩa petri cho dịch mẫu tràn đều trên bề mặt thạch, dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dịch mẫu thấm hoàn toàn trên bề mặt lớp thạch thứ hai Chú ý khơng để dịch mẫu dích vào thành đĩa petri Các đĩa thạch được nuôi cấy ở nhiệt độ khoảng 28 oC đến 32 oC trong thời gian từ 3 ngày đến 5 ngày
Theo dõi, xác định vi sinh vật đối kháng trong q trình ni, làm thuần các vi sinh vật đối kháng và lưu giữ trên thạch nghiêng trong tủ lạnh Vi sinh vật có hoạt tính đối kháng là vi sinh vật hình thành khuẩn lạc tạo được vịng đối kháng (vòng trong suốt) bao quanh khuẩn lạc
2 5 5 2 Đánh giá khả năng đối kháng nấm Phytophthora của các VSV phân lập
Khả năng đối kháng nấm Phytophthora của các vi sinh vật trong phịng thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Wen – Chuan Chung và cs (2011), theo đó miếng khuẩn lạc (0,5mm) nấm bệnh được cấy truyền tại điểm giữa của hộp petri, vi sinh vật đối kháng được cấy đối xứng trong hộp petr, đối chứng không cấy vi sinh vật đối kháng và xác định hoạt tính thơng qua kích thước vịng ức chế sau 7-10 ngày theo cơng thức: H = (Dc – Dt)/Dc x 100, trong đó: Dc là đường kính tản nấm ở cơng thức đối chứng, Dt là đường kính tản nấm ở cơng thức cấy vi sinh vật đối kháng
Hiệu quả đối kháng% = {(D - d) x 100}: D Thang tính hiệu quả ức chế
HQUC ≤ 50% 50% < HQUC ≤ 60% 60% < HQUC ≤ 75% HQUC > 75 Thấp Trung bình Cao Rất cao + ++ +++ ++++
2 5 5 3 Định danh các vi sinh vật đối kháng và xác định cấp độ an toàn sinh học
Vi sinh vật đối kháng có hoạt tính cao được định danh bằng phương pháp truyền thống thông qua đặc điểm tế bào, khuẩn lạc và các phản ứng sinh hóa (Bergey' manual ) và phương pháp sinh học phân tử Phương pháp sinh học phân tử định danh vi sinh vật đối kháng được thực hiện như sau:
DNA được chiết từ các mẫu vi sinh vật nuôi cấy trên môi trường theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987) DNA được hòa trong 50 uL đệm TE và bảo quản ở -20⁰C
Hai Mồi Phy1F và Phy1R (Hà Viết Cường và cộng sự, 2010) được dùng để nhân 1 đoạn ~ 800 bp từ vùng mã hóa 16S RNA ribosome của vi khuẩn
Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq polymerase của hãng Fermentas với nhiệt độ gắn mồi ở 500C
Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Hàm lượng DNA được ước lượng nồng độ bằng điện di agarose Sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp 1 chiều dùng mồi PCR và kít BigDye® Terminator v3 1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) trên máy PCR Sản phẩm giải trình tự được tinh chiết, làm khô và gửi đọc tại Viện Cơng nghệ sinh học tại Hà Nội Trình tự nucleotide được biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene)
Dựa trên các trình tự thu được, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology
Information) (http://www ncbi nlm nih gov/BLAST/ ) Mức độ an toàn sinh học của các vi sinh vật tuyển chọn được đánh giá gián tiếp bằng cách so sánh tên vi sinh vật đã định
danh với danh mục các vi sinh vật an tồn cấp độ 1 (khơng gây hại cho người, động, thực vật và được sử dụng không hạn chế) của Cộng đồng châu Âu (TRBA 460, 466; 2015, 2016)
2 5 5 4 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của VSV đối kháng a Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, pH:
Các vi sinh vật đối kháng tuyển chọn được nuôi cấy trong mơi trường phù hợp với từng lồi ở các nhiệt độ 250C, 300C, 350C, 400C và 450C; pH ban đầu là 5; 6; 7; 8; 9 Xác định mật độ vi sinh vật sau 48 giờ nuôi cấy theo TCVN 4884-1:2015: phương pháp định lượng vi sinh vật - phần 1: đếm khuẩn lạc ở 300C bằng kỹ thuật đổ đĩa
Vi khuẩn được cấy trên mơi trường thạch đĩa petri LB đường kính 9cm (Tryptone (10,0g) ; Yeast extract (5,0g); Sodium Cloride (10,0g); Nước cất (1000ml) ; Agar (10,0g); pH (7,5 ± 0,2) theo hai phương pháp chấm điểm và cấy zia Sau đó để ở các mức nhiệt độ 250C, 300C, 350C, 400C và 450C; pH ban đầu là 5; 6; 7; 8; 9, mỗi mức nhiệt độ và pH 3 đĩa Đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn sau 2, 3 ngày
Xạ khuẩn được cấy trên mơi trường thạch đĩa petri Gauze đường kính 9cm theo các phương pháp chấm điểm và cấy zia Sau đó để ở các mức nhiệt độ 250C, 300C, 350C, 400C và 450C; pH ban đầu là 5; 6; 7; 8; 9 khác nhau, mỗi mức nhiệt độ 3 đĩa Đánh giá khả năng sinh trưởng sau 3, 5, 7 ngày Thành phần môi trường Gauze: Tinh bột tan (20g); K2HPO4 (0,5g); MgSO4 (0,5g); KNO3 (1,0g); NaCl (0,5g); FeSO4 (0,01g); Nước cất (1000ml); pH 6,8-7,0
b Xác định các phản ứng sinh lý, sinh hóa của VSV đối kháng
* Phương pháp xác định tính yếm khí của các nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn đối kháng
Môi trường sử dụng: Peptone 2g; NaCl 5g; KH2PO4 0 3g; Agar 3g; Bromthymol blue (1%) 3ml; nước cất 1000 ml; pH = 7,0
- Phương pháp thực hiện: Đổ 5ml môi trường vào ống nghiệm, hấp khử trùng 1210C trong 20 phút, thêm 0,5 ml Glucose 10% vào mỗi tuýp, cấy mỗi nguồn vi sinh vật vào 2 tuýp, bổ sung 1 lớp dày khoảng 5mm parafilm lỏng (đã hấp khử trùng) để tạo điều kiện kị khí sau đó để ở điều kiện nhiệt độ 280C Nếu có sự chuyển màu từ xanh sang đỏ ở cả 2 tp thì đó là vi khuẩn yếm khí
* Phương pháp xác định khả năng đồng hóa nguồn các bon từ đường Glucose và Sacarose của các nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng
Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon của vi khuẩn:
+ Môi trường sử dụng : (NH4)2SO4 2g; MgSO4 7H2O 0,2g; NaH2PO4 H2O 0,5g; CaCl2 2H2O 0,1g; K2HPO4 0,5g; Nước cất 1000 ml
+ Nguồn các bon: D-glucose, Saccarose, tinh bột, Glycerol và Maltose
+ Phương pháp thực hiện: Bổ sung nguồn các bon (1%) vào mơi trường khống cơ bản, chia vào các ống nghiệm (5ml) và hấp khử trùng ở 121oC, 30 phút Lấy vi khuẩn hoạt hóa trên môi trường KB bằng que cấy cho vào từng ống nghiệm riêng biệt, mỗi loài vi khuẩn cấy 3 ống, 3 ống đối chứng không cấy vi khuẩn Sau 2-5 ngày nhỏ dung dịch Bromthymol Blue, nếu môi trường chuyển từ màu xanh sang da cam hoặc vàng nhạt là vi khuẩn có khả năng đồng hóa nguồn các bon
Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon của xạ khuẩn:
+ Khả năng đồng hóa nguồn Carbon: Xạ khuẩn được ni cấy theo phương pháp chấm điểm và cấy zia trên mơi trường ISP-9 có bổ sung 1% các nguồn đường: D-glucose, sacarose, cellulose, mannitol, maltose, glycerol Môi trường ISP-9: (NH4)2SO4 (2,64g); KH2PO4 (2,38g); K2HPO4 3H2O (5,65g); MgSO4 7H2O (1,0g); Dung dịch B (1ml); Agar (20g); pH (7,0) Dung dịch B: CuSO4 5H2O (0,64g); FeSO4 7H2O (0,11g); MnCl2 4H2O (0,79g); ZnSO4 7H2O (0,15g); Nước cất (100ml)
* Xác định hoạt độ enzym Amylaza, chitinase, β-glucanase và cellulase của các vi sinh vật đối kháng
Để tìm hiểu cơ chế đối kháng, các vi sinh vật đối kháng tuyển chọn được đánh giá xác định hoạt độ enzym Amylaza, chitinase, β-glucanase và cellulase Phương pháp được tiến hành theo Nguyễn Đức Lượng, (2004) thơng qua đường kính vịng phân giải trên mơi trường cảm ứng tổng hợp của từng loại enzym
2 5 5 5 Xác định khả năng đối kháng của vi sinh vật đối kháng trong điều kiện đất nhà lưới
Đất được khử trùng, trộn đều với 100ml dung dịch của 03 loài nấm Phytophthora (mật độ 104 bào tử/ml) Sau 10 ngày, mỗi chậu có chứa 2kg đất được xử lý 10ml dung dịch của các loài VSV đối kháng với mật độ 3,5 x 107 bào tử/ml
Cơng thức thí nghiêm 5 cơng thức
1 B amyloliquefaciens (BHA12 2), 2 B methylotrophicus (BNB3 8), 3 S misionensis (STL2 7)
4 Trichoderma hazianum 5 Đối chứng xử lý nước cất
Các chậu được đặt trong nhà lưới, tưới ẩm hàng ngày Thí nghiệm gồm 4 cơng thức, 3 lần nhắc lại
Kiểm tra mật độ nấm Phytophthora tồn tại trong đất sau 15 ngày, 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng bằng mồi bẫy cánh hoa hồng
Cho 10 gam đất vào cốc thêm vào mỗi cốc 90 ml nước cất quấy đều để qua đêm, thả 25 cánh hoa hồng vào mỗi cốc nước có chứa dung dịch đất thí nghiệm và theo dõi cánh hoa bị nhiễm nấm (tính biến màu của cánh hoa), tính tỷ lệ % cánh hoa bị biến màu
Hiệu quả phịng trừ tính theo cơng thức Abbott HQPT (%) = ( � − � )×100�
Trong đó:
+ C: Tỷ lệ bệnh ở công thức đối chứng ( Không xử lý)
+ T: Tỷ lệ bệnh ở cơng thức thí nghiệm ( xử lý vi sinh vật đối kháng)
2 5 5 6 Khả năng hạn chế nấm Phytophthora của chế phẩm CB-1 trong nhà lưới
Đất được khử trùng, trộn đều với 100ml dung dịch của 03 loài nấm Phytophthora (mật độ 104 bào tử/ml) Sau 10 ngày, mỗi chậu có chứa 2kg đất được xử lý 2,5; 5,0 và 10g chế phẩm CB-1 Các chậu được đặt trong nhà lưới, tưới ẩm hàng ngày Thí nghiệm gồm 4 cơng thức, 3 lần nhắc lại Cơng thức thí nghiệm: Cơng thức CT1 CT2 CT3 CT4 P palmivora Phyto-1 2,5 5,0 10 Đ/C P nicotianae Phyto-3 2,5 5,0 10 Đ/C P citrophthora M2 2,5 5,0 10 Đ/C
Kiểm tra mật độ nấm Phytophthora tồn tại trong đất sau 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng bằng mồi bẫy cánh hoa hồng
2 5 5 7 Khả năng hạn chế nấm Phytophthora của chế phẩm CB-1 và một số chế phẩm sinh học khác ngoài đồng ruộng
Thí nghiệm diện hẹp gồm 7 cơng thức, mỗi cơng thức 5 cây được thực hiện trên cây cam 7 – 8 năm tuổi tại xã Trưng Vương, huyện Hòa An với thuốc trừ nấm sinh học Actinovate 1SP (Streptomyces lydicus WYEC 108), chế phẩm CB-1 và 1 số chế phẩm khác, 3 lần nhắc lại Cơng thức thí nghiệm: Cơng thức CT 1: Actinovate 1SP CT 2 SH-BV 1 CT 3 Phyto-M CT 4 Tricô ĐHCT Nồng độ 2,5g/cây 80g/cây 80g/cây 2,5g/cây Công thức CT 4 CB-1 CT 6 Bio-VAAS 1 CT 7 Đ/C (không xử lý) Nồng độ 80g/cây 80g/cây
Phương pháp thực hiện: Chế phẩm được xử lý 2 lần, lần 1 sau khi thu hoạch quả (T12 – T1), lần 2 vào trước mùa mưa (T4) Các chế phẩm được hòa vào nước để tưới vào gốc với lượng 4L/cây
Chỉ tiêu theo dõi: TLB (%) và CSB (%) ở 1, 3 tháng sau xử lý lần 2 và hiệu lực của thuốc (%) Tính hiệu quả phịng trừ theo cơng thức Henderson Tillton
Hiệu lực (%) = (1 − �� × ���� ×�� ) × 100
Ta: Tỷ lệ bệnh (Chỉ số bệnh) ở công thức xử lý sau phun Tb: Tỷ lệ bệnh (Chỉ số bệnh) ở công thức xử lý trước phun Ca: Tỷ lệ bệnh (Chỉ số bệnh) ở công thức đối chứng sau phun Cb: Tỷ lệ bệnh (Chỉ số bệnh) ở công thức đối chứng trước phun
Phương pháp lấy mẫu đất, rễ: Mẫu được lấy tại rìa tán cây theo 3 điểm của hình tam giác đều lấy gốc cây làm trung tâm, độ sâu từ 10 – 20cm, mỗi mấu lấy 500g đất, 15g rễ, trộn đều các điểm thành 01 mẫu Lấy mẫu vào trước các đợt bón chế phẩm, mỗi cơng thức 3 mẫu, ghi rõ thời gian, địa điểm lấy mẫu
Thử nghiệm hiệu quả của thuốc BVTV đối với bệnh thối rễ, chảy gôm
Cơng thức thí nghiệm CT CT1: Tên thuốc Aliette 80WP Hoạt chất Fosetyl-aluminium 80% Nồng độ (%) 0,25
CT2: Ridomil gold 68WP Mancozeb 64%+Metalaxyl 4% 0,3 CT3: CT4: CT5: CT6: CT7: Vidoc 80WP Agri fos – 400 CB-1 Bio-VAAS 1 Đ/C không xử lý Copper Oxychloride 80% Axit Phosphoric VSV đối kháng VSV đối kháng 1% 0,5% 80g/cây 80g/cây
Phương pháp thực hiện: Thuốc được xử lý 2 lần mỗi lần cách nhau 7 ngày Cây thí nghiệm đều nhiễm bệnh ở mức độ nhẹ CSB% khoảng 5-7% Gạt nhẹ lớp đất mặt xung quanh tán và gốc cây để lộ phần rễ, sau đó xử lý nước thuốc vào phần rễ với liều lượng 10 lít/cây
Chỉ tiêu theo dõi: TLB (%) và CSB (%) ở 1, 3 tháng sau xử lý lần 2 và hiệu lực của thuốc (%) Tính hiệu quả phịng trừ theo cơng thức Henderson Tillton
2 5 5 8 Nghiên cứu sử dụng chế phầm CB-1 trong hệ thống quản lý tổng hợp bệnh thối rễ chảy gôm
Nghiên cứu phương pháp sử dụng chế phẩm CB-1
Thử nghiệm diện rộng trên vườn quýt Trà Lĩnh 7 năm tuổi với 4 công thức, mỗi công thức 30 cây, không nhắc lại
Cơng thức thí nghiệm: CT1: Ủ cùng phân hữu cơ CT2: Bón trực tiếp chế phẩm
CT3: Hịa chế phẩm và tưới CT4: Đối chứng
Phương pháp xử lý: Chế phẩm được xử lý 1 lần vào thời điểm sau thu hoạch với liều lượng 80g/cây
Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu lực phòng trừ nấm Phytophthora trong đất vườn cây có múi của chế phẩm CB-1 theo phương pháp bẫy cánh hoa hồng, sau xử lý 1, 3, 6 tháng, tính hiệu lực phịng trừ theo cơng thức Henderson Tillton
Thử nghiệm diện rộng trên vườn quýt Trà Lĩnh 7 năm tuổi với 4 công thức, mỗi cơng thức 30 cây, khơng nhắc lại
Cơng thức thí nghiệm: CT1: Xử lý sau thu hoạch CT2: Sau thu hoạch + trước
CT3: Sau thu hoạch + trước + cuối mùa mưa CT4: Đối chứng
mùa mưa
Phương pháp xử lý: Chế phẩm được xử lý với nồng độ 80g/cây bằng phương pháp tưới xung quanh tán cây
Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu lực phòng trừ nấm Phytophthora trong đất vườn cây có múi của chế phẩm CB-1 theo phương pháp bẫy cánh hoa hồng, sau xử lý 1, 3, 6 tháng, tính hiệu lực phịng trừ theo cơng thức Henderson Tillton
Sử dụng chế phẩm CB-1 và phân bón
Thử nghiệm diện rộng trên vườn quýt Trà Lĩnh 7 năm tuổi với 4 công thức, mỗi công thức 30 cây, khơng nhắc lại
Cơng thức thí nghiệm:
CT1: 50 kg phân chuồng + nền nông dân (2,0 kg NPK/cây) CT2: Bón theo năng suất vụ trước (tương đương 30 kg quả/ cây)
(50kg phân chuồng+1,1 kg Urê+1,4 kg lân supe+0,6 kg kaliclorua +2 kg vôi bột)/cây
CT3: CT 2 + chế phẩm CB-1
CT4: Đối chứng (nền nông dân: 2,0 kg NP/cây)
Phương pháp xử lý: Chế phẩm được ủ cùng phân chuồng cho hoai mục trước khi bón cho cây
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh ở trước xử lỹ và sau xử lý 3, 6 tháng Theo dõi năng suất của các công thức
Sử dụng chế phẩm CB-1 kết hợp với tỉa cành, tạo tán và vệ sinh đồng ruộng
Thử nghiệm diện rộng trên vườn quýt Trà Lĩnh 7 năm tuổi với 4 công thức, mỗi công thức 30 cây, khơng nhắc lại
Cơng thức thí nghiệm: CT1 - Chỉ cắt tỉa
CT2 – Cắt tỉa + Vệ sinh vườn
CT3 – Cắt tỉa + CB-1
CT4 – Cắt tỉa + vệ sinh vườn + CB-1 Phương pháp: Cắt tỉa theo quy trình chăm sóc cây ăn quả có múi của viện Bảo vệ thực vật cắt tỉa 04 đợt trong năm gồm sau thu hoạch, vụ xuân, hè và vụ thu Vệ sinh vườn gồm làm cỏ, loại bỏ cây tạp, qt vơi tồn bộ gốc và thân cây
Chế phẩm CB-1 được sử dụng với liều lượng 80g/cây/lần sử dụng, chế phẩm được tưới 3 lần vào các thời điểm sau thu hoạch, trước và cuối mùa mưa, lượng nước tưới 4l/cây
Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá hiệu lực phòng trừ nấm Phytophthora trong đất vườn