2. Nội dung
2.4.2.Phương pháp xác ựịnh sự có mặt của virus Newcastle trong nước
khi gây nhiễm huyễn dịch não gà nghi bệnh
Tiến hành phản ứng ngưng kết hồng cầu gà HA (Haemagglutination test) - Nguyên liệu:
Hồng cầu gà 1%
Nước trứng có chứa virus sau khi gây nhiễm huyễn dịch óc gà nghi bệnh Nước sinh lý vô trùng
Bơm tiêm, kim tiêm ựể tiêm trứng
Các dụng cụ, thiết bị (tủ ấm, tủ sấyẦ), hóa chất (Xitrat Natri, cồn-Iod) dùng cho phản ứng
* Chuẩn bị:
Hồng cầu gà 1%: Lấy 10ml máu của tim gà khỏe mạnh +5ml xitrat natri 5% ựể chống ựông.
Ly tâm 2000 vòng/ phút, hút bỏ nước trong ở phắa trên ựi, thu lấy hồng cầu. Cho nước sinh lý vào rửa hồng cầu, ly tâm hút bỏ phần nước trong (làm như vậy 3 lần). Cuối cùng ựược hồng cầu ựặc.
Lấy hồng cầu ựặc pha với nước sinh lý thành hỗn dịch 1%.
- Chuẩn bị nước trứng chứa virus: Lấy óc của gà trong ựàn ựang xảy ra bệnh Newcastle nghiền và pha với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/10. Khử tạp khuẩn bằng kháng sinh rồi tiêm vào phôi thai gà 10 ngày tuổi, tiêm 0,2 ml vào xoang niệu mô, ấp tiếp ở 370C sau 2- 4 ngày, những phôi gà chết, lấy ra ựể ở tủ lạnh 0- 40C/6h. Sau
ựó mổ trứng thu nước trứng, thử vô trùng bằng cách cấy trên các môi trường. Nước trứng này ựược giữ ở tủ lạnh âm.
+Tiến hành phản ứng:
Phản ứng có thể tiến hành trên ống nghiệm, trên tấm nhựa vi ngưng kết (Microplates) có 96 lỗ ựáy chữ U hoặc ựáy chữ V.
Cho các thành phần vào dãy phản ứng theo sơ ựồ:
-Dùng micropipet nhỏ vào tất cả các giếng, mỗi giếng 50ộl nước sinh lý. Sau ựó cho vào giếng thứ nhất 50ộl nước trứng chứa virus. Trộn ựều rồi hút sang giếng thứ hai 50ộl. Tiếp tục làm như vậy cho hết giếng thứ 10 thì hút bỏ ựi 50ộl.
Như vậy ựộ pha loãng nước trứng từ giếng 1 ựến giếng 10 theo thứ tự lần lượt từ 1/2; 1/4; 1/8Ầ1/1024.
-Nhỏ 50ộl hồng cầu 1% vào tất cả các giếng.
- Lắc ựều, ựể tấm nhựa ở nhiệt ựộ phòng, sau 20 phút ựọc kết quả.
-Phản ứng dương tắnh: hồng cầu ngưng kết nằm rải ựều ở ựáy giếng như hình cái dù lộn ngược.
-Phản ứng âm tắnh: hồng cầu lắng xuống ựáy thành cục tròn ựỏ, giống ựối chứng âm.
Sơ ựồ tiến hành phản ứng HA đối chứng Ô giếng số Nguyên liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (-) (+) Nước sinh lý (ộl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Nước trứng chứa virus (ộl) 50 50
Hiệu giá 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024