ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.2. Tách chiết DNA
DNA được tách chiết từ máu ngoại vi theo phương pháp Phenol/ Chloroform
Các bước gồm: Loại bỏ hồng cầu và phá vỡ màng tế bào → Phá vỡ màng nhân → Loại protein → Tủa DNA → Rửa tủa → Hòa tan DNA
Quy trình cụ thể:
- Bước 1 : Loại bỏ hồng cầu và phá vỡ màng tế bào
+ Cho vào ống eppendorf 1.5 ml: 0.5ml dung dịch phá vỡ hồng cầu (Lysis buffer) + 0.5ml máu toàn phần chống đông EDTA
+ Trộn đều, ủ trong đá (10 phút)
+ Ly tâm 8000v/phút x 10 phút/4ºC
+ Loại dịch nổi, thu cặn A
Lặp lại quy trình này 4 lần cho tới khi tủa (nhân và xác tế bào) từ nâu thành trắng ở đáy ống.
- Bước 2: Phá vỡ màng nhân
+ Ống eppendorf 1.5ml chứa cặn A + 0.5ml dung dịch K (dung dịch hỗ trợ phá màng tế bào và cố định nhân)
+ Trộn đều, để 10 phút ở nhiệt độ phňng
+ Ly tâm 8000v/phút x 10 phút/4ºC
+ Loại dịch nổi, thu cặn B
+ Cặn B + 0.5ml dung dịch Lysis buffer + 0.5µl SDS 10% + 10µl proteinase K.
+ Sau đó đem ủ ở 56ºC/2h-3h kèm theo lắc nhẹ để phân hủy protein, hòa tan tủa thu dung dịch C
- Bước 3: Tủa DNA
+ Thêm dung dịch Phenol: Chloroform: Isoamyl
• Dung dịch C + 0.5ml dung dịch Phenol: Chloroform: Isoamyl (25: 24: 1) là dung dịch tủa protein.
• Trộn đều và ly tâm 10000v/phút x 10 phút/4ºC
• Hỗn hợp phân thành 3 lớp: lớp trên cùng có chứa DNA, lớp giữa là cặn tế bào, lớp dưới cùng là dịch chiết.
Chú ý: Lặp lại bước này một lần nữa để đảm bảo không còn lẫn tạp chất trong mẫu thu dung dịch D’
+ Thêm dung dịch Chloroform: Isoamyl
• Dung dịch D’ + 0.5ml Chloroform: Isoamyl (24:1).
• Trộn đều và ly tâm 10000v/phút x 10 phút/4ºC
• Hỗn hợp phân thành 2 lớp: thu lớp dịch trên cùng (Dung dịch E)
• Lặp lại bước này một lần nữa thu dung dịch E’ (đã loại bỏ hoàn toàn protein)
+ Tủa DNA:
• Trộn 1V dịch E + 2.5V Ethanol 100% + 0.1V Sodium Acetate 3M.
• Lắc đều, ủ qua đêm ở -20°C để kết tủa DNA
• Ly tâm 13000v/phút x 20 phút/4ºC thu tủa F
• Tủa F rửa bằng 1ml Ethanol 70% , trộn đều và ly tâm 13000v/phút x 10 phút/4ºC thu được tủa DNA (lặp lại 2 lần)
• Tủa DNA để khô tự nhiên (56 ºC), sau đó hòa tan bằng đệm TE hoặc nước cất 2 lần.
+ Sản phẩm DNA tách chiết được sẽ được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng đo mật độ quang trên máy Nano Drop ở bước sóng 260nm và 280nm.
+ Sản phẩm đạt yêu cầu khi tỉ lệ A260/A280 = 1.8-2.0
Chú ý: Sản phẩm DNA tách chiết được bảo quản ở 4ºC trong thời gian ngắn hoặc lưu giữ ở -20ºC trong thời gian dài.