Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm 2 mạch đơn được cấu tạo từ 4 loại nucletid khác nhau đó là: A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine). Các nucleotid này liên kết với nhau theo một thứ tự xác định. Giải trình tự gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 nucleotid này trên phân tử DNA.
Vào giữa thập kỷ 70, có hai quy trình giải trình tự như sau được đưa ra gần như cùng một lúc:
- Phương pháp của Maxam và Gilbert (1977) cắt đứt sợi đôi DNA tại các vị trí đặc biệt bằng các phản ứng hoá học.
- Phương pháp Sanger (1977) dùng enzym xúc tác sợi bổ sung tương ứng của một chuỗi DNA cần xác định trình tự, những sản phẩm tổng hợp bị chấm dứt tại một điểm đặc biệt nào đó.
Hiện này phương pháp của Sanger được sử dụng phổ biến cả ở Việt Nam lẫn thế giới; phương pháp hoá học ít được ứng dụng do độc tính của hoá chất.
Phương pháp của Sanger sử dụng ddNTP (dideoxyribonucleoside triphosphate) là các đồng phân của dNTP (deoxyribonucleoside triphosphate), còn được gọi là “terminator”. Cấu trúc ddNTP tương tự dNTP chỉ có một điểm khác biệt duy nhất là ddNTP không có gốc OH ở đầu 3’ (vị trí carbon 3 của deoxyribose), là vị trí để các dNTP tiếp theo gắn vào. Do đó, phản ứng tổng hợp DNA sẽ được dừng lại tại ngay vị trí mà ddNTP được gắn ngẫu nhiên vào thay cho dNTP.
Hình 1.10. Hình ảnh minh họa kỹ thuật giải trình tự theo phương pháp Sanger [13].
Giải trình tự một DNA có thể chia làm 2 bước lớn: PCR giải trình tự và đọc trình tự trên máy tự động.
Bước 1: PCR giải trình tự.
Thành phần của hỗn hợp phản ứng gồm:
- DNA khuôn
- Primer (mồi xuôi hoặc mồi ngược)
- DNA polymerase
- dNTPs
- 4 loại ddNTP được đánh dấu 4 mầu huỳnh quang khác nhau: + dideoxyThymine (T*)
+ dideoxyAdenine (A*) + dideoxyGuanine (G*) + dideoxyCytosine (C*)
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự: 960C : 1 phút 960C : 10 giây 500C : 5 giây x 25 chu kỳ 600C : 4 phút 150C
Kết quả của phản ứng PCR giải trình tự là có rất nhiều sợi DNA được tạo thành. Các sợi này có độ dài hơn kém nhau 1 nucleotid.
Sản phẩm PCR giải trình tự sẽ được điện di và đọc kết quả trên máy.
Bước 2: Đọc trình tự trên máy tự động.
Để thực hiện đọc trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Bốn loại ddNTP thường được đánh dấu bằng bốn màu huỳnh quang khác nhau.
Cấu tạo của một máy điện di gồm 2 phần: phần chạy điện di trên gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di.
Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia sáng laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA [3].
Hình 1.11. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR giải trình tự
Trong quá trình điện di: sợi có kích thước ngắn sẽ di chuyển nhanh hơn sợi có kích thước dài
CHƯƠNG II.