3.1. Nghiên cứu thu nhận enzym từ Bacillus subtilis :
3.1.1.Hoạt hoá giống và quan sát một số đặc điểm hình thái của
Bac.subtilis:
Chủng vi khuẩn Bac.subtilis sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ phòng thí nghiệm bộ môn bảo quản chế biến nông sản trường Đại học Nông Lâm -Huế. Sau một thời gian bảo quản, để đảm bảo giống không bị thoái hoá, tôi tiến hành hoạt hoá và tuyển chọn lại.
Để thu được chủng vi khuẩn Bac.subtilis thuần khiết, chúng tôi tiến hành nuôi nó trên môi trường thạch-thịt-pepton trong 24h ở 300C. Rồi tiến hành phân lập lựa chọn dựa trên nguyên tắc pha loãng để tách từng khuẩn lạc riêng biệt.
Để thuần khiết vi khuẩn Bac.subtilis, chúng tôi sử dụng môi trường thạch-thịt- pepton, được hấp tiệt trùng 1210C trong 30 phút. Bằng phương pháp pha loãng thập phân canh trường chứa vi khuẩn như ở sơ đồ hình 1 đã mô tả. Tương ứng với mỗi độ pha loãng thập phân lấy 0,1ml canh trường cho lên bề mặt của môi trường thạch trong mỗi hộp peptri. Dùng que trang dàn đều canh trường trên bề mặt thạch nhằm thu được các khuẩn lạc riêng rẽ. Các hộp peptri được nuôi trong 24h ở 350C, các khuẩn lạc xuất hiện thì đem ra quan sát. Khuẩn lạc mọc trên hộp peptri phụ thuộc vào độ pha loãng . Sơ đồ pha loãng như sau:
Canh trường Vi khuẩn 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml Bac.subtilis 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml Môi trường Thạch-thịt-pepton 1 2 3 4 5
Hình 1: Sơ đồ thí nghiệm phân lập và chọn giống
Bảng 1:Một số đặc điểm về hình thái của khuẩn lạc Bac.subtillis trên môi trường thạch-thịt-pepton
Sau khi nhận thấy ở hộp peptri số 5 các khuẩn lạc mọc riêng lẻ, chúng tôi tiến hành quan sát hình dáng khuẩn lạc :
• Hình dạng chung: dạng rễ. • Màu sắc khuẩn lạc: màu trắng. • Đặc tính bề mặt: trơn ướt
• Đặc tính mép khuẩn lạc: mép hình răng cưa, xẻ không đều.
Sau đó chọn các khuẩn lạc còn trẻ, riêng biệt để cấy chuyền qua ống thạch nghiêng và được nuôi ở 300C trong 24h và được bảo quản ở 40C, sau một tháng thì cấy chuyền qua ống thạch nghiêng để giữ và bảo quản giống.
3.1.2.Khảo sát khả năng tổng hợp proteaza của Bac.subtillis trên môi trường rắn:
Bac.subtilis từ ống thạch nghiêng, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng phát triển của nó trên môi trường đĩa thạch có thành phần môi trường sữa như đã trình bày ở mục 8 phần phụ lục.
Sau khi Bac.subtilis được cấy trên đĩa thạch, chúng tôi tiến hành nuôi ở 300C trong 24h
Nhận xét:
Độ pha loãng Số khuẩn lạc đếm được Đặc điểm khuẩn lạc
10-6 Rất nhiều Các khuẩn lạc rất nhỏ, dính lại với nhau
10-7 98 7 khuẩn lạc dính lại với nhau
10-8 67 4 khuẩn lạc dính lại với nhau
10-9 42 Từng khuẩn lạc mọc riêng lẻ
Trên môi trường sử dụng, Bac.subtilis đã sử dụng nguồn cơ chất để sinh trưởng và phát triển. Bên cạnh quá trình sử dụng nguồn cacbon, nitơ có trong môi trường thì
Bac.subtilis đã sinh tổng hợp proteaza làm thuỷ phân protein trong sữa. Chính vì vậy, ta thấy ở đĩa thạch có miền trắng đục do protein của sữa chưa bị thuỷ phân và miền trắng trong bao quanh khuẩn lạc do protein của sữa đã bị thuỷ phân, chỉ còn lại bề mặt của đĩa thạch.
Hình ảnh
Ta tiến hành nhuộm màu đĩa thạch trên với thuốc nhuộm amido black 10B để kiểm tra khả năng thuỷ phân của proteaza .
Amido black 10B là một loại thuốc nhuộm có khả năng bắt màu với protein cho màu xanh, dựa vào đặc tính này người ta có thể xác định được vị trí của protein bị thuỷ phân trên đĩa thạch bằng cách đem nhuộm đĩa thạch trong dung dịch amido black 10B. Quá trình tiến hành như sau:
Pha thuốc nhuộm trong dung dịch acid axetic 7% để đạt thuốc nhuộm có nồng độ 0,025%.
Hút 5ml dung dịch thuốc nhuộm cho đều vào đĩa thạch trên. Để yên trong 24 giờ.
Sau 24 giờ nhuộm màu ta thấy trên đĩa thạch có những vùng màu xanh và vùng trong suốt. Những vùng màu xanh là do trong sữa có cazein là protein chưa bị thuỷ phân nên nó bắt màu với thuốc nhuộm. Còn vùng trong suốt là vùng protein đã bị thuỷ phân, do đó nó không bắt màu với thuốc nhuộm.
Hình ảnh
3.1.3.Khảo sát khả năng sinh tổng hợp proteaza của Bac.subtilis trên môi trường lỏng:
Để thu được nguồn enzym dồi dào từ vi sinh vật, người ta phải nuôi cấy chúng trên các môi trường đặc hiệu. Về nguyên tắc, có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu enzym: phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy bề sâu.Việc
nghiên cứu sản xuất enzym bằng phương pháp bề mặt đã được tiến hành và cho kết quả tốt. Tuy nhiên, do sản xuất enzym theo phương pháp bề mặt có nhiều nhược điểm hơn so với phương pháp nuôi cấy bề sâu. Chính vì vậy, trên thế giới việc sản xuất enzym theo phương pháp bề mặt chỉ chiếm 10%, còn lại 90% được thay thế bằng phương pháp chìm.
Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề sâu so với phương pháp nuôi cấy bề mặt: Tiết kiệm diện tích sản xuất.
Dễ cơ giới hoá, loại bỏ được lao động thủ công, tạo năng suất cao.
Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng của môi trường, tránh được sự lãng phí chất dinh dưỡng nằm lại trong khối canh trường ỳ rắn mà vi sinh vật không sử dụng được.
Thu được enzym chứa ít tạp chất hơn.
Đảm bảo được điều kiện vệ sinh và vô trùng, do đó hiện tượng nhiễm vi sinh vật lạ ít xảy ra hơn.
Do những ưu điểm trên mà chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp proteaza của Bac.subtilis trong môi trường lỏng.
Khi sử dụng phương pháp nuôi cấy chìm thì môi trường để vi khuẩn phát triển là môi trường lỏng. Thành phần môi trường thích hợp cho Bac.subtilis phát triển và sinh tổng hợp proteaza theo Đỗ Thị Bích Thuỷ bao gồm: pepton:0,5%; cao thịt: 0,05%; NaCl: 0,5%;cao nấm: 0,1%; tinh bột sắn: 5,5%; bột phế liệu tôm: 1,1%; nước 1000ml; pH=10[12,tr74]
Trong phương pháp nuôi cấy chìm, để đảm bảo điều kiện vô trùng thì phải thực hiện theo hai bước:
Môi trường lỏng được tiệt trùng ở 1210C trong 30 phút . Quá trình cấy giống tiến hành trong điều kiện vô trùng.
Sau khi cấy giống với tỉ lệ 2%, pH môi trường bằng 10 thì vi sinh vật được nuôi ở 350C. Quá trình nuôi được thực hiện trong máy lắc .[16,tr71]
Trong quá trình nuôi vi sinh vật ở những điều kiện như vậy, do môi trường có độ nhớt cao nên giai đoạn đầu quá trình sinh tổng hợp enzym rất chậm, môi trường rất đục nên không thể kiểm tra động thái sinh trưởng và phát triển của Bac.subtilis mà chúng tôi chỉ tiến hành kiểm tra quá trình sinh tổng hợp enzym ngoại bào của nó .
Để kiểm tra khả năng sinh tổng hợp enzym ngoại bào của Bac.subtilis, chúng tôi sử dụng phương pháp chuẩn độ foocmol ở thời điểm cách nhau 8 giờ. Dịch chiết enzym được thu nhận bằng cách lọc qua bông thấm nước .
Dịch chiết enzym sau khi thu nhận được đánh giá hoạt lực proteaza.
Về nguyên tắc, để đánh giá hoạt lực enzym bất kỳ có thể dựa vào tốc độ chuyển hoá của cơ chất hoặc tốc độ tích luỹ sản phẩm phản ứng sau một thời gian nhất định. Ở đây, để xác định hoạt lực enzym proteaza, chúng tôi dựa vào lượng sản phẩm tạo thành sau khoảng thời gian xác định.Theo mức độ thuỷ phân protein, nhóm cacboxyl và nhóm amin tự do trong dung dịch tăng lên. Dựa vào độ tăng một trong hai nhóm này để xác định hoạt độ enzym.
Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành xác định hoạt lực enzym proteaza theo phương pháp chuẩn độ foocmol, bằng cách cho dịch chiết enzym tác dụng với 5ml dung dịch cazein 1% trong thời gian 30 phút ở 300C. Dưới tác dụng của enzym proteaza, các nhóm acid amin giải phóng ra. Sau đó bao vây nhóm amin, còn chuẩn độ nhóm cacboxyl. Hoạt lực enzym càng cao thì hàm lượng acid amin càng lớn.
Hoạt độ enzym ở đây được tính bằng miligam đạm amin được tạo thành sau 1 giờ ở điều kiện nhiệt độ và pH xác định, cũng có thể tính bằng đơn vị hoạt động enzym.
HđP(1đvhđ/1ml): đơn vị hoạt động của enzym theo phương pháp chuẩn độ foocmol. Một đơn vị hoạt động là lượng enzym mà sau một giờ ở 300C và pH thích hợp có thể phân giải protein tạo thành 1 mg acid amin.( 2, tr296)
Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym proteaza tại các thời điểm khác nhau. Kết quả thu được biểu diễn ở hình 2.
Hình 2: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym proteaza của Bac.subtilis.
Dựa vào kết quả thu được chúng tôi nhận thấy rằng sau 88 giờ nuôi cấy thì
Bac.subtilis có khả năng sinh tổng hợp proteaza là mạnh nhất. Hoạt lực enzym proteaza tại thời điểm đó là 5.68HđP.
Trong khoảng thời gian 64÷88giờ nuôi cấy thì khả năng sinh tổng hợp proteaza của Bac.subtilis rất mạnh. Đây là giai đoạn sinh tổng hợp proteaza mạnh nhất trong suốt quá trình sinh tổng hợp của Bac.subtilis.
Qua các nghiên cứu cho thấy rằng quá trình sinh tổng hợp proteaza diễn ra chủ yếu trong giai đoạn phát triển luỹ tiến của vi sinh vật. Ở giai đoạn này, vi sinh vật phát triển mạnh mẽ dẫn đến nhu cầu dinh dưỡng cao, cho nên nó phải sinh tổng hợp enzym mạnh để thuỷ phân cơ chất, tạo nhiều các chất dinh dưỡng để hấp thụ.
Năm 1973, Conovalop đã kết luận rằng:"Sự phát triển tế bào và sự sản sinh enzym có liên quan chặt chẽ với nhau. Tế bào vi sinh vật sẽ sinh tổng hợp enzym ở các giai đoạn nhất định trong quá trình sinh trưởng. Tốc độ sinh tổng hợp enzym thường không đồng nhất với chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật".
Sau 88 giờ thì hoạt lực proteaza của Bac.subtilis giảm dần, điều đó có thể giải thích rằng càng về cuối quá trình nuôi cấy thì hàm lượng chất dinh dưỡng trong môi
trường nuôi cấy đã cạn kiệt, vi sinh vật trải qua giai đoạn suy vong, nên khả năng sinh tổng hợp proteaza của nó cũng yếu dần.
Như vậy, sau 88 giờ nuôi cấy trong môi trường thay thế có pH bằng 10 ở nhiệt độ 350C thì chúng tôi thu nhận được enzym proteaza từ Bac.subtilis có hoạt lực mạnh nhất.
Không phải mỗi loài vi sinh vật chỉ sinh tổng hợp một loại enzym nhất định mà chúng có thể tổng hợp nhiều loại enzym khác nhau với hàm lượng không giống nhau và điều đó tùy thuộc vào phương pháp nuôi cấy và nhiều yếu tố khác. Năm 1988 và 1996, tác giả Đỗ Thị Giang và Lê Đức Mạnh dùng Bac.subtillis để sinh tổng hợp α -
amylaza theo phương pháp lên men bề mặt và phương pháp lên men bề sâu. Điều đó
khẳng định một lần nữa trong tế bào vi sinh vật tồn tại nhiều hệ enzym khác nhau. Do đó tuỳ thuộc vào phương pháp và môi trường nuôi cấy mà ta có thể thu nhận được các loại enzym khác nhau.
3.1.4.Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện hoá lý đến hoạt tính của chế phẩm enzym proteaza từ Bac.subtilis:
Cũng như các loại enzym khác, tốc độ phản ứng hay hoạt tính của enzym đều chịu sự tác động của nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ của các ion trong môi trường, nồng độ chất kìm hãm, chất hoạt hoá, do đó hoạt lực của chế phẩm proteaza có thể tăng hoặc giảm. Tìm ra các điều kiện mà enzym có hoạt lực cao nhất gọi là điều kiện tối ưu cho enzym hoạt động .
3.1.4.1. Ảnh hưởng của NaCl đến hoạt tính của enzym proteaza :
Qua rất nhiều nghiên cứu người ta nhận thấy rằng khi nồng độ NaCl tăng thì hoạt lực của enzym giảm xuống. Do khi nồng độ muối cao sẽ tạo ra một áp suất thẩm thấu tác động lên cấu trúc phân tử enzym và cơ chất, làm ức chế phản ứng enzym. Để biết được mức độ ức chế, tốc độ giảm hoạt tính và nồng độ NaCl nào thì enzym proteaza bị ức chế hoàn toàn. Tôi đã bổ sung muối có các nồng độ 3%, 8%, 13%, 18%, 23%, 28%vào dịch chiết enzym, sau đó cho tác dụng với cơ chất cazein 1% trong 1giờ ở
300C, rồi dùng phương pháp chuẩn độ foocmol để xác định hoạt tính của nó. Quá trình xử lý trong nước muối được tiến hành như sau:
* Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml dung dịch nước muối có nồng độ khác nhau, hút 1ml dịch canh trường enzym môi trường tối ưu cơ bản cho vào mỗi ống nghiệm , để yên trong 24giờ, sau đó tiến hành xác định hoạt độ của enzym trong các nồng độ muối khác nhau.
Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt tính enzym proteaza
NaCl 0 3 8 13 18 23 28
HđP(1đvhđ/1ml) 5.68 5.112 2.84 1.136 0.568 0.284 0
Hình 3: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt tính enzym proteaza
Trong khoảng nồng độ muối từ 0÷3% thì hoạt lực của enzym giảm nhưng ở mức
độ thấp, tại 3% NaCl thì hoạt lực enzym vẫn còn 90% so với hoạt lực ban đầu nhưng khi NaCl tăng lên 8% thì hoạt lực enzym giảm còn 50% hoạt lực so với ban đầu. Đến khi nồng độ muối 23%, enzym chưa mất hoạt tính hoàn toàn, còn được 5% so với ban đầu và khi NaCl tăng lên 28% thì hầu như hoạt lực của enzym không còn.
Do đó khi đưa enzym proteaza vào ứng dụng trong môi trường cần có NaCl thì ta phải chú ý đến thời điểm bổ sung NaCl và nồng độ NaCl thích hợp để ảnh hưởng của nó đến hoạt tính enzym là thấp nhất.
Đồng thời với quá trình khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt tính enzym proteaza thì tôi cũng tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sống sót của Bac.subtillis khi thay đổi nồng độ muối từ 0% , 3%, 8%, 13%, 18%, 23%, 28%.
Quá trình tiến hành như sau:
Chuẩn bị dung dịch nước muối ở các nồng độ khác nhau thay đổi từ 0%÷28%,
sau đó cho dịch canh trường enzym vào, để yên trong 24 giờ, tiếp theo tiến hành nuôi canh trường enzym trong các hộp peptri chứa môi trường thạch-thịt-pepton. Quá trình nuôi trong 24 giờ, ở nhiệt độ 300C. Sau 24 giờ nuôi, tôi nhận thấy rằng khả năng sống sót của vi khuẩn Bac.subtillis giảm dần khi nồng độ muối tăng dần, cụ thể là số khuẩn lạc đếm được giảm dần, khi đến nồng độ muối 23% thì chỉ còn 4÷5 khuẩn lạc với tốc
độ phát triển rất chậm. Khi nồng độ muối đạt đến 28% thì không có dấu hiệu của khuẩn lạc, điều đó chứng tỏ rằng ở nồng độ muối 28% thì vi khuẩn Bac.subtillis không còn khả năng sống sót, bị ức chế hoàn toàn.
Như chúng ta đã biết, trong tế bào vi sinh vật thấy có mặt hàng loạt các chất khoáng khác nhau. Vi sinh vật lấy chất khoáng từ môi trường dinh dưỡng. Những chất khoáng của môi trường có nhiều ý nghĩa sinh lý khác nhau. Một trong những tính chất của chúng là làm thay đổi trạng thái hoá keo của tế bào chất. Dưới tác dụng của các muối vô cơ, lớp bề mặt tế bào không ngừng thay đổi và dẫn đến làm thay đổi tốc độ của các phản ứng enzym trong quá trình trao đổi chất. Trong đó muối ăn (NaCl) có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình dinh dưỡng của vi sinh vật. Khi bổ sung muối ăn vào môi trường nuôi cấy thì ngoài tác dụng cung cấp nguồn ion Cl−, nó còn có tác dụng làm thay đổi sức thẩm thấu của màng tế bào, tạo điều kiện cho việc tiết enzym từ
vi khuẩn vào môi trường dễ dàng. Từ kết quả khảo sát trên, khi bổ sung NaCl vào môi trường nuôi cấy thì phải chú ý đến hàm lượng NaCl bổ sung vào phải thích hợp, nếu nồng độ quá cao nó sẽ ức chế sự sinh trưởng phát triển của vi khuẩn .(10,Trang 59 )
3.1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ :
Theo quy luật của phản ứng hoá học thông thường thì nhiệt độ càng tăng thì vận tốc phản ứng càng tăng, nhưng vì enzym có bản chất là protein, do đó vận tốc phản ứng