CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2. Đánh giá một số đặc tính về công thức và hiệu quả của chế phẩm probiotic
3.2.3. Khả năng sống sót của vi sinh vật
Để chế phẩm phát huy được tác dụng và đạt hiệu quả cao thì số lượng vi sinh vật cịn sống cần phải được kiểm sốt tốt. Thí nghiệm nhằm mục đích xác định số lượng lợi khuẩn có trong các chế phẩm. Thơng thường đối với trẻ em, giá trị này cần nằm trong khoảng 107-108 CFU/liều hay 7-8 log CFU/liều và tối thiểu là 106 CFU/liều hay 6 log CFU/liều [9], [31]. Phương pháp được áp dụng là phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng vi sinh vật trong chế phẩm đã trình bày ở mục 2.3.3.2.
Tiến hành khảo sát khả năng sống sót của cả 4 cơng thức CT-26.4, CT-26.5, CT- 27.2, CT-27.3 khi mới bào chế và sau 1 tháng bào chế để theo dõi sự giảm số lượng vi sinh vật của các mẫu. Tuy nhiên, khi đánh giá hiệu quả của chế phẩm về số lượng vi sinh vật cịn sống sót sau 2 tháng bào chế chỉ tiến hành trên các công thức đã được lựa chọn là CT-26.5, CT-27.3.
Cách tiến hành:
Lấy chính xác một lượng chế phẩm tương đương với 1 liều sử dụng (5 giọt hoặc 0,25 ml) cho vào ống eppendorf, thêm khoảng 0,80 ml mơi trường pha lỗng PBS 4% Tween rồi đem lắc vortex kỹ trong 1 phút.
Đem ống eppendorf đi ly tâm ở tốc độ 15.000 vòng/phút trong 2 phút. Loại bỏ phần dịch chứa tạp chất, phần cắn thu được tiếp tục làm các bước thêm mơi trường pha lỗng, vortex, ly tâm như trên.
Loại bỏ dịch rồi chuyển hết phần cắn trong ống eppendorf vào một ống nghiệm chứa sẵn 5 mL mơi trường pha lỗng PBS 4% Tween. Vortex kỹ thu được dịch cần pha loãng.
Pha loãng dịch trên đến nồng độ thích hợp. Hút chính xác 10,00 µL dịch tại 4 nồng độ cuối cấy lên các đĩa petri có mơi trường MRS thạch đã tiệt trùng. Đặt đĩa vào tủ ấm 37℃, 5% CO2, sau 48-72h tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa. Mỗi thí nghiệm tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Kết quả:
Hình 3.9. Khuẩn lạc L. acidophilus trên môi trường thạch sau 48h
Đặc điểm khuẩn lạc: Khuẩn lạc L. acidophilus hiện lên màu trắng đục, hình trịn,
nổi mơ, bìa diềm, nằm trên đường cấy chuyển và khơng lẫn với những vi sinh vật có hình thái hay màu sắc lạ khác.
Bảng 3.6. Số lượng vi sinh vật của một số công thức ngay sau khi bào chế Công
thức
Lần đếm
Số lượng khuẩn lạc/nồng độ pha lỗng Kết quả (log CFU/liều) Trung bình (log CFU/liều) 10-3 10-4 10-5 10-6 27.3 1 170 36 2 0 7,08 7,13 ± 0,22 2 118 20 2 0 6,94 3 180 41 3 1 7,37 26.4 1 >300 100 16 0 7,81 2 >300 96 18 1 7,80 7,82 ± 0,03 3 >300 125 11 2 7,86 27.2 1 >300 108 19 1 7,82 2 >300 188 25 2 8,02 7,91 ± 0,10 3 >300 138 23 1 7,89 26.5 1 >300 119 24 0 7,95 2 >300 108 28 5 8,17 8,05 ± 0,11 3 >300 150 41 1 8,04
Chú thích: >300 là quy ước khi số lượng khuẩn lạc quá nhiều và nhỏ.
Nhận xét:
Lượng vi sinh vật thu được trong hỗn dịch ngay khi bào chế của các mẫu có độ ổn định tốt đều đạt ~ 8 log CFU/liều tương ứng với 108 CFU/liều, đáp ứng tốt yêu cầu của chế phẩm probiotic cho trẻ em đã nêu ra ở mục 1.1.3. Trong đó, CT-26.5 có số lượng vi sinh vật thu được cao nhất với 8,05 ± 0,11 log CFU/liều.
Như đã nêu ở mục 1.4.2.2, ngun liệu đơng khơ ban đầu chứa 3×1010 CFU/g tương ứng với 8,18 log CFU/liều theo nhà sản xuất công bố. Khi kiểm tra lại số lượng vi sinh vật ban đầu theo phương pháp pha loãng liên tục được nêu ở mục 2.3.3.1 cho kết quả xấp xỉ số lượng trên bao bì. Vì vậy số lượng vi sinh vật trong các mẫu được kiểm tra đều đạt kết quả tốt.
Bảng 3.7. Số lượng vi sinh vật trong các công thức sau 1 tháng Công
thức
Lần đếm
Số lượng khuẩn lạc/nồng độ pha loãng Kết quả (log CFU/liều) Trung bình (log CFU/liều) 10-3 10-4 10-5 10-6 27.3 1 2 19 1 0 6,69 6,44 ± 0,36 2 23 2 0 0 6,03 3 20 2 2 0 6,60 26.4 1 122 7 1 0 6,69 2 160 25 2 1 7,30 7,19 ± 0,46 3 >300 65 9 0 7,59 27.2 1 140 14 0 0 6,84 2 227 23 3 0 7,10 7,16 ± 0,36 3 >300 62 8 0 7,55 26.5 1 174 22 1 1 7,27 2 143 23 4 0 7,11 7,22 ± 0,10 3 216 54 0 0 7,28 26.5 (giữ lạnh) 1 >300 126 14 1 7,78 2 >300 131 19 2 7,94 7,90 ± 0,11 3 >300 128 16 3 7,99
Chú thích: >300 là quy ước khi số lượng khuẩn lạc quá nhiều và nhỏ. CT-26.5 (giữ lạnh) được bảo quản trong tủ lạnh từ khi làm ra.
Bảng 3.8. Số lượng vi sinh vật trong công thức 26.5 và 27.3 sau 2 tháng Công
thức
Lần đếm
Số lượng khuẩn lạc/nồng độ pha lỗng Kết quả (log CFU/liều) Trung bình (log CFU/liều) 10-3 10-4 10-5 10-6 26.5 1 60 5 0 0 6,44 6,50 ± 0,22 2 43 4 0 0 6,32 3 47 9 2 0 6,75 27.3 1 52 3 1 0 6,48 2 56 5 0 0 6,42 6,34 ± 0,20 3 32 2 0 0 6,11
Nhận xét: Số lượng vi sinh vật được xác định sau khoảng 1 tháng (30 ngày) cho
kết quả số lượng đều thấp hơn so với các mẫu đếm ngay. Ngay khi bào chế xong có kết quả từ 7,13-8,05 log CFU/liều, sau 1 tháng chỉ còn từ 6,44-7,22 log CFU/liều, số lượng giảm khoảng 5-10 lần so với ban đầu. Các mẫu đếm sau 2 tháng (60 ngày) số lượng vi sinh vật đã giảm rõ rệt, còn lại ~ 6 log CFU/liều tương ứng với 106 CFU/liều. Tuy nhiên, kết quả này vẫn đáp ứng được yêu cầu tối thiểu của chế phẩm probiotic cho trẻ em đã nêu ở mục 1.1.3.
Nổi bật là công thức 26.5 khi được bảo quản trong điều kiện lạnh cho số lượng vi sinh vật duy trì ổn định từ 8,05 ± 0,11 log CFU/liều xuống 7,90 ± 0,11 log CFU/liều; chỉ giảm 1,4 lần sau 1 tháng bảo quản. Bên cạnh đó, cơng thức 26.5 khi được bảo quản lạnh (7,90 ± 0,11 log CFU/liều) cho số lượng vi sinh vật lớn hơn so với công thức 26.5 khi được bảo quản trong điều kiện thường (7,22 ± 0,10 log CFU/liều) với số lượng giảm 6,8 lần sao với ban đầu sau 1 tháng.
Bàn luận:
Số lượng vi sinh vật được xác định giảm sau 1-2 tháng có thể do các nguyên nhân như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng hoặc do quá trình sử dụng chế phẩm đa liều.
Về nhiệt độ, trên thực tế sau khi được sản xuất, chế phẩm được bảo quản tại phịng thí nghiệm trong nhiệt độ thường, chịu sự dao động nhiệt độ lên xuống theo thời tiết. Từ kết quả bảng 3.7, CT-26.5 được bảo quản lạnh cho kết quả tốt hơn cho thấy nhiệt độ tăng cao có ảnh hưởng bất lợi đến sự ổn định của vi sinh vật. Trong một số nghiên cứu trước đó đã chỉ ra rằng sản phẩm probiotic có thể được bảo quản càng mát thì khả năng tồn tại của lợi khuẩn càng cao [39], [50].
Số lượng vi sinh vật giảm xuống có thể do ảnh hưởng bởi độ ẩm và hoạt độ nước (aw). Độ ẩm tăng cao làm vi sinh vật trở lại trạng thái hoạt động, sinh trưởng, già hóa và dần chết đi. Trong nghiên cứu của S.K.Mody năm 2019, ông đã chỉ ra rằng hỗn dịch dầu chứa lợi khuẩn ổn định khi aw nằm trong khoảng 0,001 đến 0,35 aw [39].
Trong một số nghiên cứu khác đã đề cập tới vấn đề giảm độ ổn định của chế phẩm đa liều trong quá trình sử dụng [17], [32]. Chế phẩm giảm mạnh số lượng tế bào vi sinh vật sau 2 tháng có thể do việc mở nắp làm oxy, khơng khí hay những yếu tố mơi trường bên ngoài xâm nhập vào chế phẩm làm chết vi sinh vật.
Kết luận:
Có sự giảm số lượng vi sinh vật theo thời gian trong các mẫu. Sau 60 ngày, các công thức 26.5, 27.3 đều đạt yêu cầu tối thiểu về số lượng vi sinh vật cịn sống sót trong cơng thức.