2.5.3.3. Xác đ nh hàm l ng polyphenol t ng có trong d ch chi t
Sauăkhiăthuăđ c d ch chi t, ti n hành pha loãng ra các n ngăđ phù h p nh m thuăđ c dung dchăcóăđ h p thu n m trong kho ng tuy n tính c aăđ ng chu n gallic acid. Ti năhƠnhăđoăm uăt ngăt nh ăb c l păđ ng chu n acid gallic.ă i v i m u kem c năxácăđ nhăhƠmăl ng polyphenol t ng, ti n hành chu n b m uăđoănh ăsau:ăCơnă 0,05găkemăvƠă0,45mLăn c, hòa tan vào nhau b ngăcáchăđánhăsiêuăơmăt 2-3 phút.
HƠmăl ng polyphenol t ng trong d ch chi tăđ c tính theo công th c: V
TPC=GAE f m
(Cơng th c 2.2) Trongăđó:ă
TPC (mg GAE/g ngun li uăkhơ)ălƠăhƠmăl ng polyphenol t ng tính trên 1 g ngun li u khô.
GAEă(mg/L)ălƠăhƠmăl ng polyphenol suy ra t đ ng chu n gallic acid. f là h s pha loãng c a d ch chi t.
V (L) là th tích c a d ch chi tăthuăđ c. m (g) là kh iăl ng c a nguyên li u khô.
28
2.5.4. Xác đ nh hàm l ng chlorophyll
N ngăđ chlorophyll trong d ch chi tăđ căxácăđnh b ngăph ngăphápăđoăquangă ph .
M u đ că đoă đ h p thu b c sóng 665 nm và 652 nmă vƠă đ nhă l ng chlorophyll theo công th c:
652 665
[chl-ab]=22,12 A +2,71 A ( g/L) (Công th c 2.3)
HƠmăl ng chlorophyll trong lá di păcáăđ c tính theo cơng th c: [chl-ab] f V [chl-x] m = (Cơng th c 2.4) Trongăđó:
[chl-x] ( g/gănguyênăli uăkhô)ălƠăhƠmăl ng chlorophyll trong lá di p cá khô.
[chl-ab] ( g/L)ălƠăn ngăđ c a chlorophyll có trong d ch chi t. f là h s pha loãng c a d ch chi t.
V (L) là th tích c a d ch chi tăthuăđ c. m (g) là kh iăl ng c a nguyên li u khơ.
2.5.5. ánh giá ho t tính kháng oxy hóa 2.5.5.1. Ph ng pháp ABTS
a. C ăch đánhăgiá
Các ch t kháng oxy hóa trong m u cao chi t s kh g c t do ABTS+ có màu l c lamăđ n xanh ng c v d ng ABTS+ không màu. Ho tătínhăkhángăoxyăhóaăđ căxácăđ nh khiăđoăđ h p thu t iăb c sóng 734 nm v i ch tăđ i ch ng là ascorbic acid (vitamin C) [25].
b. Sàng l c kho ng n ngăđ c ch
M uăđ c phân tán trong dung dchăđ m phosphate pH = 7,4 thành các n ngăđ th nghi m 100, 10, 1 ppm.
ABTSăđ c hòa tan trongăn c v i n ngăđ 7ămmol/Lăsauăđóăđ c tr n v i dung d ch kali persulfate (K2S2O8) 2,45 mmol/L theo t l 1:1 r i trong bóng t i nhi tăđ
29
phịng 12-16 gi tr c khi s d ngăđ c dung d ch g c. Dung d chănƠyăđ c pha loãng b ng dung d chăđ măđ năđ h p thu OD734=0,7ă±ă0,02ătr c khi ti n hành ph n ng [25].
M uăđoăch a:
2000ă Lădungădch g căđưăphaăloưng.
1000ă Lădungădch m u n ngăđ th nghi m. M uăđ i ch ng ch a:
2000ă Lădungădch g căđưăphaăloưng.
1000ă Lădungădch ascorbic acid 0,6 mg/mL. M u tr ng ch a:
2000ă Lădungădch g căđưăphaăloưng. 1000ă Lădungăd chăđ m pH 7,4.
H n h păđ c l căđ u,ăđ yên cho ph n ng nhi tăđ phòng trong 30 phút r i ti năhƠnhăđoăđ h p thu.
c. Xácăđ nh giá tr IC50
T k t qu kh o sát m u các n ngăđ th nghi m, ti n hành thí nghi măt ngă t v i 7 n ngăđ phù h p. M i n ngăđ m uăđ c th c hi n ít nh t 3 l năđ tính giá tr trung bình.
M u cao chi t: n ngăđ l năl t là 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,5625; 0,7813 ppm. Ph nătr mă c ch cation g c t doăđ c tính theo cơng th c sau:
o (A) %Q 1- 100% (A ) = (Công th c 2.5) Trongăđó:
AălƠăđ h p thu c a dung d ch ch a m u th .
AolƠăđ h p thu c a dung d ch ch a m u tr ng [26].
Giá tr IC50đ căxácăđ nh t đ ng cong bi u di n m i quan h gi a n ngăđ và ph nătr mă c ch (%Q).
30
a. C ăch đánhăgiáă
G c t doăDPPHăbanăđ u có màu tím s chuy n sang màu vàng do có s tácăđ ng c a các ch t kháng oxy hóa. Kh n ngăb t g c t do c a ch t nghiên c uăđ căxácăđ nh b ngăph ngăphápăđoăđ h p thu t iăb căsóngă517ănm.ăAscorbicăacidă(vitaminăC)ăđ c s d ng làm ch tăđ i ch ng [25].
b. Sàng l c kho ng n ngăđ c ch
M uăđ c hòa tan trong methanol các n ngăđ th nghi m 1000, 100, 10 ppm. DPPHăđ c hòa tan trong methanol n ngăđ 6 mmol/L.
M uăđoăch a: 2400ă Lămethanol.
500ă Lădungădch m u n ngăđ th nghi m. 100ă Lădungădch DPPH trong methanol.
Th c hi năt ngăt đ i v i m uăđ i ch ng và m u tr ng, ch thayăđ i dung d ch m u b ng dung d ch ascorbic acid n ngăđ 0,6 mg/mL trongădungămôiăDMSOă(đ i v i m uăđ i ch ng) ho cămethanolă(đ i v i m u tr ng).
H n h păđ c l căđ u,ăđ yên cho ph n ng nhi tăđ phòng trong 30 phút r i ti năhƠnhăđoăđ h p thu [27].
i v i m u kem c năđoăph nătr mă c ch g c t do %Q, dung d ch m uăđ c chu n b nh ăsau:ăCơnă0,1 găkemăvƠă0,4ămLăn c,ăsauăđóăhịaătanăb ngăcáchăđánh siêu âm h n h p trong 2-3 phút. i v i m u gi l p, s d ngă0,5ăgă(t ngăđ ngă0,5ămL)ă s n ph măđ x lýăvƠăđoăđ c. Giá tr Qăt ngăđ ngăđ c tính b ng cách t l 1/5 giá tr Q thu th c t , s d ngăkhiăsoăsánhăt ngăđ ng s n ph m kem.
c. Xácăđ nh giá tr IC50
T k t qu kh o sát m u các n ngăđ th nghi m, ti n hành thí nghi măt ngă t v i 7 n ngăđ phù h p. M i n ngăđ m uăđ c th c hi n ít nh t 3 l năđ tính giá tr trung bình.
31
Ph nătr măb t g c t doăDPPHăđ c tính theo cơng th c sau: c o c (A-A ) %Q 1- 100% (A -A ) = (Cơng th c 2.6) Trongăđó:
AălƠăđ h p thu c a dung d ch ch a m u th . AolƠăđ h p thu c a dung d ch ch a m u tr ng
AclƠăđ h p thu c a dung d ch ch a ch tăđ i chi u [28].
Giá tr IC50đ căxácăđ nh t đ ng cong bi u di n m i quan h gi a n ngăđ và ph nătr mă c ch (%Q).
2.5.6. ánh giá tính ch t c a kem n n và s n ph m 2.5.6.1. Xác đnh pH
pH c a s n ph măđ căđoăb ng máy Toledo t i phịng thí nghi m B mơn K Thu t Hóa H uăC ,ăđ i h c Bách Khoa Tp. HCM.
Các s n ph măch măsócădaănênăcóăđ pH t 5.0-6.0ăđ khơng làm nhăh ngăđ n pH sinh lý trên da.
2.5.6.2. Xác đnh c u trúc
Phân tích c u trúcăđ c s d ngăđ xácăđ nhăcácăđ c tính k t c u c a m ph m và liênăquanăđ n vi căđoăđ căđi măc ăh c c a m u khi m u ch u nh ngătácăđ ngăđưăđ c ki m soát. Ph ngăphápănƠyădùngăđ đánhăgiáăvƠăsoăsánhănhi uăđ c tính k t c u liên quanăđ n c m quan c a các s n ph m qua vi c thu th p s li u liên quan các thu c tính c ăậlýăc ngănh ătínhăl uăbi n c a m ph m.
32
Hình 2.6 Máy đo l c k thu t s Handpi instruments
2.5.6.3. Xác đ nh đ dàn tr i
Cách th c hi n:
D ng c đ c s d ng là 2 t m kính trịn ph ngăcóăđ ng kính b ng 10 cmăvƠăđ dày b ng 3 mm cùng v i m t qu cân chu n 200g. Cân m tăl ng s n ph m kho ng 0,8 găvƠăđ t tâm c a t măkínhăphíaăd i. C đnh t măkínhăphíaăd iăvƠăđ t nh t m kính cịn l i lên trên sao cho m u s n ph m n m tâm c a c 2 t m kính. Th i gian t lúc b t đ uăđ t 2 t măkínhăvƠoănhauăđ nălúcăđ t qu cân chu n là 5 giây, ti p t c tính th i gian trong 30 giây. K tăthúcăphépăđo,ănh c nh qu cân chu n và ch p l i hình nh. D a trên hình nhăđưăl uăđ tínhătốnăđ ng kính c a s n ph măsauăkhiăđ c tr i r ng b i l c tác d ng c a v tă100ăg.ă dàn tr i là di n tích c a m uăkemăsauăkhiăđo.
Hình 2.7 Minh h a ph ng pháp đo đ dàn tr i
2.5.6.4. Màu s c
Các thông s mƠuăđ căđoăb ng máy Chroma Meter CR-400 d a trên khơng gian màu CIE LCh cịn g i là CIE L*C*h, dùng tr c t aăđ hình tr d ng hình c u v i 3 tr c. Màu s căđ c th hi n b ng nh ng con s và s p x p chúng m t cách có h th ng, trong
33
đóăm i màu có m t v trí theo các tr c: Tr c h (hue hay tone) th hi n góc tơng màu ho c ánh màu, t 0o (mƠuăđ )ăđ n 90o (màu vàng), 180o(xanhăláăcơy)ăđ n 270o (xanhăd ng)ă quay l i 0o. Tr căCă(Chromaticity)ăđ i di năchoăđ bão hòa ho căđ thu n s căđiăt 0 tâm c aăvòngătròn,ăđ nă100ăgiaăt ngăph thu c kho ng cách t t aăđ mƠuăđ n tâm và tr c L (Lightness) mô t đ sáng chuy n t mƠuăđen tuy tăđ i (L = 0) thành màu tr ng tuy tăđ i (L = 100). Các m uăđ căđoămƠuătr c ti p không c n pha lỗng, trong cuvet th y tinh 1 cm.
Tính tốn đ l ch màu trong h th ng CIELCh
L* = L2*- L1* : s khác nhau v đ sáng gi a hai màu
C*= C2*- C1* : s khác nhau v đ bão hòa
h: s khác nhau v tơng màu
E: kho ng cách hình h c c a hai màu
Ki m tra s khác bi t màu s c theo th i gian:
E = 紐岫系茅岻態髪 岫月岻態髪 岫詣茅岻態
E : cho bi t kho ng cách hình h c c a hai màu trong m t h th ng.
B ng 2.7 Phân lo i s khác bi t v v trí màu
E n m gi a 0 và 1 Thôngăth ng s khác bi t này không th c m nh năđ c
E n m gi a 1 và 2 Khác bi t r t nh , ch c m nh năđ c b iăng i có kinh nghi m
E n m gi a 2 và 3.5 Khác bi tăt ngăđ i, có th c m nh năđ c b iăng i khơng có kinh nghi m
E n m gi a 3.5 và 5 Khác bi t l n E l năh nă5 Khác bi t r t l n
M t s quyă c v h ng l ch màu:
L* mang d u (+) : s l chămƠuătheoăh ng sáng lên
34
2.5.6.5. ánh giá c m quan
Ph ngăphápăđánhăgiáăc m quan s n ph măălƠăph ngăphápăđánhăgiáăd a vào thangăđi măđánhăgiáăs n ph m. Thangăđi mănƠyădoăng i xây d ng công th c m ph m t o ra nh măđ aăraăm t s ch tiêuăc ăb năđ đánhăgiáăm u s n ph m. T đó,ăđi u ch nh cơng th c b ng vi c l a ch năvƠăđi u chnhăhƠmăl ng nguyên li u.
B ng 2.8Tiêu chí đánh giá c m quan
Tiêuăchíăđánhăgiá mi % mi % C m giác trong khi s d ng Kh n ngădƠnătr i 5 20 C m giác thoa trên da 5
Kh n ngăth m th u 5 mát trên da 5 C m giác sau khi s d ng bóng d u 5 20 m t da 5 m 5
Thangăđi măđánhăgiáăd aătrênăthangăđi m 5, chi ti tănh ăb ng 2.8.
Trongăđó:ămi% lƠăh ăs ăch ăm căđ ăquanătr ngătrongăm cătiêuăxơyăd ngăcôngăth c.
Cácăch ătiêuăđánhăgiáăc ăth ănh ăsau:
• Kh ăn ngădƠnătr i: ánhăgiáăđ ădƠnătr iăc aăm uăm ăph mătrênăda.
Dùng m tăl ng b ng nhau c a các m uăđangăxétă(dùng ngón tay ch m nh trên b m tăđ l y kem), thoa lên b m t da và kéo nh nhàng trên da trong m t ph n di n tích c đnh.
• Kh ăn ngăth măth u: ánhăgiáăkh ăn ngăth măth uăc aăm uăs năph măquaăth iăgiană th măth uăc aăs năph măvƠoăda.
Dùng m tăl ng b ng nhau c a các m uăđangăxétă(dùng ngón tay ch m nh trên b m tăđ l yăkem)ăđ thoa lên b m t da. Tính th i gian th m th u t lúc b tăđ u thoa choăđ n khi m uătrênădaăđưăkhô.ăTh i gian th m th u càng ng n,ăđi măđánhăgiáăcƠngăcao.
35
• ăbóngăda: Sauăkhiăthoaăxong,ăm uăs năph măsauăkhiăđưăth măth uăvào da thì xem xétătrênădaăcóăđ ăbóngăc aăd uăgơyăraăhayăkhơng.ăDaăcƠngăítăb ăbóngăd u,ăđi măđánhăgiáă càng cao.
• ăm tăda: Sauăkhiăthoaăxong,ăm uăs năph măđưăth măth uăvƠoăda,ădùngăcácăđ uă ngónătayăđ ăki mătraăđ ăm tătrênăda.ăDaăcƠngăm t,ăđi măđánhăgiáăcƠngăcao.
B ng 2.9Thang đi m đánh giá c m quan
i m 5 4 3 2 1 ánhăgiá R t t t T t B ng lòng Kém R t kém ▪ C m quan khi s d ng i măđánh giá Tínhăn ng 1 2 3 4 5 dàn tr i R t khó Khó Bìnhăth ng D R t d C m giác thoa trên da R t khó ch u Khó ch u Bìnhăth ng H iăd ch u D ch u Kh n ngă th m th u R t khó Khó Bìnhăth ng D R t d
mát trên da Không mát H iămát Bìnhăth ng Mát R t mát
▪ C m qu n sau khi s d ng i măđánh giá Tínhăn ng 1 2 3 4 5 bóng d u R t nh n Nhanh nh n Nh n Bình th ng Khơng nh n
m t da Khơngăm t H iăm t Bìnhăth ng M t R tăm t
36
CH NGă3: K T QU VÀ BÀN LU N
3.1. CHU N B VẨă ÁNHăGIÁăNGUYÊNăLI U
iăt ng nghiên c u c aăđ tài này là rau di păcá,ăđ c thu th păvƠoăđ u tháng 2/2022. Di păcáăt iăđ c lo i b thân, lá d p,ăh ,ăch thu th p lá nguyên, s đ c s y khơ nhi tăđ 50÷60ă ătrongăvịngăkho ngă3ăngƠyăđ đ măđ t t 8÷10%. Ngun li u khơăđ căl uătr trongăđi u ki n kín và tránh m m c b ngăcáchăđ trong túi khóa kín và kèm theo silicagel hút m.
Kh oăsátăs ăb cho th y d ch chi t lá di p cá khô và b t di p cá khô cung c p hƠmăl ng polyphenol t ng t ngăđ ngănhauănh ngăhƠmăl ng chlorophyllăthuăđ c khi s d ng b t di păcáăkhôăcaoăh n.ă ng th i s d ng b t di p cá gây khó kh năh nă cơngăđo n l c d ch chi t so v i nguyên li u lá di p cá khơ. Vì v yăđ iăt ng nghiên c u c aăđ tài là rau di p cá khô d ng lá.
B ng 3.1 c đi m c a nguyên li u nghiên c u
căđi m Mô t lá di p cá khô
Màu s c Màu xanh và nâu xen l n
Mùi v Mùi th oăd c,ăth mănh
m (%) 8÷10
Lá di p cá khơ
37
3.2. KH O SÁT QUÁ TRÌNH THU CHI T XU T
Các nghiên c uătr c c a nhóm trong kh o sát chi t xu t di p cá trên h dung môi ethanol- n c thuăđ c k t qu hƠmăl ng polyphenolăthuăđ c r t cao khi s d ng t l th tích 75:25 cho h dung mơi. Tuy nhiên, d ch chi t nƠy khi th nghi m ng d ng trong m ph m l iăcóăđ b năkhơngăcao,ăthayăđ i r̃ r t theo th i gian.ă i u này do hàm l ng các h p ch t mƠuănh ăchlorophyll và d n xu t c a chúng gây ra. Do v y, lu năv nă m c tiêu l a ch n h dung môi làm gi măhƠmăl ng chlorophyll mà v n gi nguyên ho căthayăđ iăkhôngăđángăk hƠmăl ng c a các ho t ch t khác trong chi t xu t c a di p cá.ă đ tăđi uăđó,ăđ nhăh ng s th nghi m v i các h dung môi ancol- n c khác nhau trong quy trình chi t.
3.2.1. D ch chi t di p cá
Di p cá s đ c chi t nhi tăđ 60÷65ă , trong th i gian 1 gi v i t l nguyên li u di p cá khô/dung môi là 1/10 g/mL. ơyălƠ đi u ki n chi t phù h păđư đ c kh o sát vƠ l a ch n d a trên nghiên c u c a nhóm nghiên c u.
3.2.1.1. nh h ng c a t l dung môi EtOH - H2O
H dung môi EtOH - H2O là h dung môi ph bi n trong chi t tách các h p ch t t nhiên. EtOH và H2O có ch s phân c c l năl t là 5,2 và 9 [29]. Tùy thu c vào t l c a EtOH - H2O mà ch s phân c c c aădungămôiăthayăđ i, d năđ n tính ch t d ch chi t thayăđ i. n i dung này, t l EtOH và H2O s đ căthayăđ i trong quy trình chi t. Sau đó,ăs n ph m chi t s đ căđánhăgiáăv ngo i quan, tính ch tăvƠăhƠmăl ng ho t ch t thu đ c.
38
B ng 3.2 Mô t ngo i quan d ch chi t di p cá v i dung môi EtOH - H2O
EtOH- H2O EtOH100 EtOH75 EtOH50 EtOH25 EtOH0
Mô t Màu xanh nâu s m,ăđ u màu
Màu xanh nâu s m,ăh iăng
vàng
Màu xanh nâu s m, ánh lên màu vàng Màu nâu ng vàng Màu nâu ng vàng m và ch t d bay h iă(%) 99,8 99,64 99,01 99,24 98,46
K t qu kh o sát v c m quan cho th y d ch chi t có s khác nhau v màu s c khi s d ng các dung mơi có t l EtOH - H2O khác nhau. D ch chi t chuy n màu t nâu s m tr nên nh t d n và chuy năsangăvƠngănơu.ă i u này cho th y khi gi m ph nătr măt l c a EtOH trong dung mơi trong quy trình chi t,ăhƠmăl ng chlorophyll và các d n xu t mƠu gi m d n.ă i u này có th lý gi i qua vi c chlorophyll và các d n xu t c a nó là nh ng h p ch t có tính phân c c th p, có xu h ng hịa tan trong nh ng dung mơi có đ phân c c th p. Khi t l EtOHăt ngălênătrongădungămôi,ălƠmăchoăch s phân c c trung bình c a dung mơi gi m xu ng, nên chlorophyll và các d n xu t c aănóăcóăxuăh ng hịa tan vào chi t xu t nhi uă h n.ă Ng c l i khi t l EtOH gi mă điă trongă dungă môi,ă chlorophyll cóăxuăh ng gi m s hịa tan vào chi t xu t, t đóăgiúpăchi t xu t tr nên