37
3.2. KH O SÁT QUÁ TRÌNH THU CHI T XU T
Các nghiên c uătr c c a nhóm trong kh o sát chi t xu t di p cá trên h dung môi ethanol- n c thuăđ c k t qu hƠmăl ng polyphenolăthuăđ c r t cao khi s d ng t l th tích 75:25 cho h dung mơi. Tuy nhiên, d ch chi t nƠy khi th nghi m ng d ng trong m ph m l iăcóăđ b năkhơngăcao,ăthayăđ i r̃ r t theo th i gian.ă i u này do hàm l ng các h p ch t mƠuănh ăchlorophyll và d n xu t c a chúng gây ra. Do v y, lu năv nă m c tiêu l a ch n h dung môi làm gi măhƠmăl ng chlorophyll mà v n gi nguyên ho căthayăđ iăkhôngăđángăk hƠmăl ng c a các ho t ch t khác trong chi t xu t c a di p cá.ă đ tăđi uăđó,ăđ nhăh ng s th nghi m v i các h dung môi ancol- n c khác nhau trong quy trình chi t.
3.2.1. D ch chi t di p cá
Di p cá s đ c chi t nhi tăđ 60÷65ă , trong th i gian 1 gi v i t l nguyên li u di p cá khô/dung môi là 1/10 g/mL. ơyălƠ đi u ki n chi t phù h păđư đ c kh o sát vƠ l a ch n d a trên nghiên c u c a nhóm nghiên c u.
3.2.1.1. nh h ng c a t l dung môi EtOH - H2O
H dung môi EtOH - H2O là h dung môi ph bi n trong chi t tách các h p ch t t nhiên. EtOH và H2O có ch s phân c c l năl t là 5,2 và 9 [29]. Tùy thu c vào t l c a EtOH - H2O mà ch s phân c c c aădungămôiăthayăđ i, d năđ n tính ch t d ch chi t thayăđ i. n i dung này, t l EtOH và H2O s đ căthayăđ i trong quy trình chi t. Sau đó,ăs n ph m chi t s đ căđánhăgiáăv ngo i quan, tính ch tăvƠăhƠmăl ng ho t ch t thu đ c.
38
B ng 3.2 Mô t ngo i quan d ch chi t di p cá v i dung môi EtOH - H2O
EtOH- H2O EtOH100 EtOH75 EtOH50 EtOH25 EtOH0
Mô t Màu xanh nâu s m,ăđ u màu
Màu xanh nâu s m,ăh iăng
vàng
Màu xanh nâu s m, ánh lên màu vàng Màu nâu ng vàng Màu nâu ng vàng m và ch t d bay h iă(%) 99,8 99,64 99,01 99,24 98,46
K t qu kh o sát v c m quan cho th y d ch chi t có s khác nhau v màu s c khi s d ng các dung mơi có t l EtOH - H2O khác nhau. D ch chi t chuy n màu t nâu s m tr nên nh t d n và chuy năsangăvƠngănơu.ă i u này cho th y khi gi m ph nătr măt l c a EtOH trong dung mơi trong quy trình chi t,ăhƠmăl ng chlorophyll và các d n xu t mƠu gi m d n.ă i u này có th lý gi i qua vi c chlorophyll và các d n xu t c a nó là nh ng h p ch t có tính phân c c th p, có xu h ng hịa tan trong nh ng dung mơi có đ phân c c th p. Khi t l EtOHăt ngălênătrongădungămôi,ălƠmăchoăch s phân c c trung bình c a dung mơi gi m xu ng, nên chlorophyll và các d n xu t c aănóăcóăxuăh ng hịa tan vào chi t xu t nhi uă h n.ă Ng c l i khi t l EtOH gi mă điă trongă dungă môi,ă chlorophyll cóăxuăh ng gi m s hịa tan vào chi t xu t, t đóăgiúpăchi t xu t tr nên nh tămƠuăh n.ă
Hình 3.2 C m quan các m u d ch chi t di p cá dung môi EtOH- H2O khi thay đ i t l c a
EtOH –N c.
Hình 3.3 nh h ng c a các t l h dung môi EtOH - H2O đ n quang ph h p thu vùng kh ki n
c a d ch chi t
39
(a)ă ánhăgiáătrênănguyênăli u khô
(b)ă ánhăgiáătrên th tích d ch chi t
Hình 3.4 ảàm l ng polyphenol t ng và chlorophyll t ng có trong d ch chi t rau di p cá v i dung môi
EtOH-N c
Trong cácăđánh giá s theo d̃iăl ng ch t chi tăraăđ c tính trên ngun li u khơ đ đánh giá hi u qu chi t vƠ trong dung d ch chi tăđ so sánh ch tăl ng s n ph m.
40
NhìnăvƠoăđ th hình 3.4,ăhƠmăl ng polyphenol t ng trong d ch chi tăthayăđ i theo s thayăđ i t l EtOH - H2O trong dung môi. m u d ch chi t v i dung môi EtOH75,ăhƠmăl ng polyphenol t ng trên 1g nguyên li u khơ là cao nh t, kho ng 43÷44 mg/g ngun li u khơ. HƠmăl ng polyphenol t ng trên 1g nguyên li u khô gi m d n trong các m u d ch chi t v i dung môi EtOH50, EtOH25, EtOH0. Th nh ngăn u tính theoăhƠmăl ng polyphenol t ng trên 1 lít d ch chi t thì m u d ch chi t EtOH50 l i có hƠmăl ng polyphenol t ng trên 1 lít d ch chi t cao nh t, caoăh năsoăv i khi s d ng dungămôiăEtOH75ă25%,ăđ t 3,72 g/L.
Xét v hƠmăl ng chlorophyll,ăhƠmăl ng ch t mƠu t ng trong d ch chi tăc ngă thayăđ i theo s thayăđ i t l EtOH - H2Oătrongădungămôi.ăHƠmăl ng chlorophyll t ng gi m d n khi dung môi gi m d năhƠmăl ngăEtOH.ă i u này ch ng minh thành ph n chloropyll n m ch y uătrongăEtOH.ăHƠmăl ng chlorophyll m u d ch chi t EtOH50 gi m h n so v iăhƠmăl ng chlorophyll m u d ch chi t EtOH75. T iăđi u ki n s d ng EtOH75,ăl ng chlorophyll t ng là 106 µg/L. T iăđi u ki n s d ng EtOH50, d ch chi t cóăl ng chlorophyll t ng là 28,1 µg/L, lƠ r t th p.
D a vào quang ph h p thu c a các m u d ch chi t v i dung mơi có t l EtOH - H2O thayăđ i, có th th y r ng các m u d ch chi t có thành ph n các h p ch t thayăđ i. T iăb căsóngă670nm,ăđnh h p thu c a chlorophyll khi dùng EtOH100 và EtOH75 cao h năh năđnh h p thu c a các m u d ch chi t khác, ng v i c m quan c a 2 m u d ch chi t này có màu s măđ m màu nh t. Tuy nhiên, vi c gi măhƠmăl ng EtOH trong dung môiăc ngălƠmăgi măđ h p thu c a m u d ch chi tătrongăvùngăb c sóng 450÷600 nm, ch ng t dung môi làm nhăh ng t iăhƠmăh ng các ch t khác trong h .
D a trên nh ng k t qu trên, có th th y r ng dung mơi EtOH50 là dung mơi thích h p trong vi c chi t di p cáăđ đ m b oăhƠmăl ng polyphenol t ng trong d ch chi t v n cao vƠ quan tr ng nh t lƠ đư gi măhƠmăl ng chlorophyllălênăđ n 70%, gi măđiămƠuă xanh l căđángăk trong s n ph m d ch chi t.
41
3.2.1.2. nh h ng c a t l dung môi propylene glycol (PG) –N c
Hình 3.5 nh h ng c a các t l h dung môi PG –
N c đ n ngo i quan d ch chi t. Hình 3.6 nh h ng c a các t l h dung môi PG - H2O đ n quang ph h p thu vùng
kh ki n c a d ch chi t
B ng 3.3 Mô t ngo i quan d ch chi t di p cá v i dung môi PG – N c
M u d ch chi t di p cá trong dung mơi PG - H2O có màu xanh s m gi m d n nh t d n và chuy n v mƠuănơuăvƠngăkhiădungămôiăthayăđ i t l PG- H2O t 100%ăPGăđ n 0% PG. T ngăt l PG s d ng c ngăxuăh ngăt ngăcác thƠnh ph năđ c chi t theo, th hi n qua mƠu s c vƠ hƠmăl ng ch t d bayăh iăthayăđ i (B ng 3.3). Tuy nhiên, khi s d ng PG thì dung mơi nƠy khóbayăh i,ăv năl uăl i trong m u nên giá tr caoăh năh n so v iătr ng h p không dùng PG hay dùng EtOH.
Quang ph h p thu cho th yăđ nh h p thu c a chlorophyll xu t hi n t i 670 nm v i các m u s d ng PG100 và PG75 cao h năh n v iăcácăđ nh h p thu c a các m u d ch chi t còn l i.ă nh h p thu c a m u d ch chi t PG75 là cao nh t (Hình 3.6). Vi c thayăđ iăhƠmăl ngăPGătrongădungămôiăc ngălƠmăthayăđ iăđ h p thu c a m u d ch chi t
PG100 PG75 PG50 PG25 PG0 Mô t S m màu, có ánh màu xanh l c S m màu, có ánh màu xanh l c Nâu s m, cóăánhăh iă xanh l c Nơuăđ m, sáng h n,ăánhălênă vàng nâu Vàng s m, sáng màu m và ch t d bay h iă(%) 86,82 81,71 88,51 87,23 98,46 100% 75% 50% 25% 0%
42
trongăvùngăb c sóng 380÷600 nm, ch ng t dung mơi làm nhăh ng t iăhƠmăh ng các ch t khác trong h .
(a)ă ánhăgiáătrênănguyênăli u khô
(b)ă ánhăgiáătrên th tích d ch chi t
Hình 3.7 nh h ng c a các t l h dung môi PG - H2O đ n hàm l ng polyphenol t ng và chlorophyll t ng trong d ch chi t
M u d ch chi t PG75 th hi n hi u qu tách polyphenol t ng cao nh t, v i giá tr polyphenol t ngăđ t 43,9 mg/g nguyên li u khơ. Trongăkhiăđó, m u d ch PG50 th hi n hi u qu chi t polyphenol t ng là 40,85 mg/g nlk,ăđ t 93% so v i giá tr polyphenol t ng
43
cao nh t c a m u d ch chi tăPG75.ăTuyănhiên,ăkhiăđánhăgiáătrênăd ch chi t s n ph m thu đ c thì m u s d ng h dung môi PG50 l iăchoăhƠmăl ng polyphenol t ng cao nh t, đ t giá tr 3,19ăg/LăvƠăcaoăh năkho ng 21% so v i giá tr t i PG75.
HƠmăl ng chlorophyll t ng trong d chăthuăđ c t ngăd n t h dung mơi s d ng lƠPG100ăđ năPG75ăvƠăsauăđóăgi m d n t PG75ăđ năPG0.ăHƠmăl ng chlorophyll t ng m u d ch chi tăPG75ăđ c th hi n cao nh t.ăHƠmăl ng chlorophyll t ng m u d ch chi t PG50 là 79,6 µg/L, gi m 46% so v iăhƠmăl ng chlorophyll t ng m u chi t PG75.
Doăđó,ăsoăv i các t l kh o sát khác c a dung mơi PG- H2O trong quy trình chi t d ch chi t di p cá, h PG50 là dung mơi thích h p nh t trong vi c chi t xu t di păcáăđ đ m b o hàm l ng ho t ch t polyphenol t ng,ă đ ng th iă đ m b oă hƠmă l ng chlorophyll t ng trong d ch đ th p, gi măđiămƠuăxanhăl c.
3.2.1.3. nh h ng c a t l dung môi Glycerin - H2O
Hình 3.8 nh h ng c a các t l h dung môi G
- ả2O đ n ngo i quan d ch chi t Hình 3.9 nh h ng c a các t l h dung môi
Glycerin - H2O đ n quang ph h p thu vùng kh ki n c a d ch chi t
B ng 3.4 Mô t ngo i quan d ch chi t di p cá dung môi Glycerin-H2O 100% 75% 50% 25% 0% 100% 75% 50% 25% 0%
44
K t qu c m quan nh n th y r ng, màu xanh nâu s m khơng cịn gi m d n khi gi m d năl ng Glycerin trong dung môi. M u d ch chi t G100 và G0 có màu nh tăh nă so v i nh ng m u d ch chi t khác. Quang ph h păthuăc ngăth hi năđnh h p thu vùng kh ki n c a m u d ch chi t t i 670 nm th p h n, ch ng t l ng chlorophyll th p h nă r t nhi u so v iăhƠmăl ng Chlorophyll t ng c a m u d ch chi t nh ng dung môi kh o sátătr c.
(a)ă ánhăgiáătrênănguyênăli u khô
G100 G75 G50 G25 G0 Mô t Màu vàng s m, sáng, đ u màu S m màu, ánh lên vàng nâu Nơuăđ m, s m, ánh lên vàng nâu Nơuăđ m, sángăh n,ăánhă lên vàng nâu Vàng s m, sáng, l p trên nh tămƠuăh n m và ch t d bay h iă(%) 5,03 28,04 40,63 65,39 98,46
45
(b)ă ánhăgiáătrênăth tích d ch chi t
Hình 3.10 nh h ng c a các t l h dung môi Glycerin - H2O đ n hàm l ng polyphenol t ng và chlorophyll t ng trong d ch chi t
Vi c s d ng h G75 th hi n hi u qu chi t polyphenol t ng cao nh t, v i giá tr polyphenol t ngăđ t 35,2 mg/g nlk.ăTuyănhiên,ăkhiăđánhăgiáătrênătínhăch t d ch chi t thu đ căthìăhƠmăl ng polyphenol t ng trên 1 lít d ch chi t c a m u G50 là 2,68 g/L và cao h năkho ng 33% so v i giá tr t i G75.
3.2.1.4. So sánh và đánh giá
i v i các h dung môi cho k t qu t t nh t,ăđi u ki n tríchălyăđ c l p l i vƠ s n ph măđ c so sánh, trình bƠy trong b ng 3.5.
B ng 3.5 So sánh tính kh d ng c a các lo i dung môi chi t
Dung môi EtOH50 PG50 G50
HƠmăl ngăpolyphenolăt ng
(g GAE/L) 3,72 3,19 2,68
HƠmăl ngăchlorophyllăt ng
46
uăđi m
-KhôngălƠmăt ngăt ă l ăl ngătrongăm ă ph m
-PGădùngăph ăbi nă trongăm ăph m -D ădƠngăph iătr că ti păvƠoăphaăn că c aăm ăph m
-Glycerine dùng ph ăbi nătrongăm ă ph m
-D ădƠngăph iătr că ti păvƠoăphaăn că c aăm ăph m Nh căđi m -EtOHăítăđ că dùngătrongăm ă ph m -Khó lo i dung mơi đ ăthuăđ căcaoă chi t -LƠmăt ngăthƠnhă ph năl ngăc aăm ă ph m -Khó dung mơi đ ă thuăđ căcaoăchi t -LƠmăt ngăthƠnhă ph năl ngătrongăm ă ph m
T k t qu kh o sát, t ng lo i dung môi, các m u d ch chi tăđ c l a ch n đ u có cácă u/khuy tăđi m khác nhau. Tuy nhiên, chúngăđ u th a các tiêu chí banăđ u liên quan vi c gi m t i thi u ch t mƠu vƠ b o t n t iăđaăt ng hƠmăl ng polyphenol t ng trong d ch chi t. Vi c l a ch n PG vƠ G tuy không gi m ch t mƠu nhi u,ănh ngăc ng có th s d ng tr c ti p d ch chi t vƠo s n ph m vì chúng có th đóng vai trị ch tăt ngă m khi s d ng.
Trong n i dung k ti p, các m u d ch chi t nƠyăđ c th nghi m lo iădungămôiăđ thu d chăđ c v iăđ nhăh ngăt ngăph m vi s d ng c a chúng.
3.2.2. Cao chi t di p cá
3.2.2.1. Các kh o sát c a cao chi t di p cá
D ch chi tăđ c lo i b ph n l n dung môi b ng thi t b côăquayăchơnăkhôngăđ thuăđ c cao chi t.ă i uănƠyălƠăđ thu n ti n trong vi c b o qu n. Cao chi t (hay g i là cao) c a d chăEtOH50ăthuăđ c có d ng khơ, khác h n d ng d ch s t t EtOH75. Các m u PG50 và G50 ch thu đ c cao chi t d ng l ng v i các tính ch t khác nhau.
47
B ng 3.6 Tính ch t cao chi t t dung môi EtOH50 và EtOH75 (*)
Ngo iăquan
Dungămôiăchi t EtOH 50% EtOH 75% (*)
MƠuăs c en en
Mùiăh ng H ngăth oăd c H ngăth oăd c
HƠmăl ngă măvƠăch tă
d ăbayăh iă(%) 2,56 16,08
Hi uăsu tăchi tăcaoă(%;ă
soăv iănguyênăli uăkhô) 24 20,33
HƠmăl ngăpolyphenolă t ngă(mgăGAE/găcaoă khơătuy tăđ i)ă
125,87 144
Ho tătínhăkhángăoxyăhóa,ăIC50 (ppm)
Ph ng pháp ABTS 5,870 2,915
48
(*) Tham kh o t nghiên c uăđ c th c hinăsinhăviênăTháiăDuyăThƠnhăvƠoăn mă2020ăt iătr ngă i h c Bách Khoa- HQG
Tp. HCM; (**) Tham kh o t nghiên c uăđ c th c hi n song song c aăsinhăviênăBƠnhăV ăLong,ătr ngă i h c Bách Khoa-
HQG Tp. HCM.
Hình 3.11 So sánh kh n ng kháng oxy hóa c a cao EtOH50 v i cao EtOH75 và vitamin C theo hai
ph ng pháp ABTS và DPPả
Cao chi t EtOH50 c aăđ tƠi có hƠmăl ng ho t tính vƠ kh n ngăkháng oxy hóa th păh năcaoăchi t EtOH75 t nghiên c u tr c. HƠmăl ng polyphenol t ng lƠ 125,87 vƠ 144 (mg GAE/g cao khô tuy tăđ i) quy v cao khô tuy tăđ i c a m u EtOH50 vƠ EtOH75.
Kh n ngăkhángăoxyăhóaăc a các m uăđ căđánhăgiáătheoăhaiăph ngăphápăABTSă và DPPH và th hi n d ng giá tr IC50. Theo c haiăph ngăpháp,ăkh n ngăkhángăoxyă hóa c a cao chi t EtOH75 th hi n h năcaoăchi t EtOH50. ph ngăphápăABTS,ăgiáă tr IC50 c a m u cao EtOH50 có giá tr là 5,82 ppm ch caoăh năg p 2 l n so v i m u EtOH75. Khi so v iăđ i ch ng vitamin C, giá tr IC50 c a m u EtOH50 ch caoăh năg p 3,6 l n. ph ngăphápăDPPH,ăgiáătr IC50 c a hai m u chênh l ch khơng q nhi u. Gía tr IC50 c a m u cao chi t EtOH50 b ng 95% giá tr IC50 c a m u cao chi t EtOH75 và g p 8,6 l n so v i giá tr IC50 c a m u vitamin C.
49
Hình 3.12 nh h ng c a các t l h dung môi EtOH –N c đ n quang ph h p thu UV-Vis c a cao di p cá
M u cao chi t EtOH75 t nghiên c uătr căkhôngăđánh giá hƠmăl ng ch t mƠu chlorophyll, tuy nhiên thƠnh ph n nƠy có th đánh giá thơng qua quang ph h p thu t i vùngăđ nh b c sóngăt ngă ng. M u t EtOH50 th hi n rõ hi u qu lo i ch t màu chlorophyllăthôngăquaăđnh h p thu t i b căsóngă670ănmăđưăm tăvƠăđ h p thu t iăb c sóng 400-500 nm gi măh năh n so v i m u EtOH75. i u này ch ng t m u cao chi t EtOH50ăcóăhƠmăl ng chlorophyll t ngăđưăgi măđiăr t nhi u.
Nh ăv y, cácăđánh giá cho th y tuy m u EtOH50 có hƠmăl ng polyphenol gi m