3. Nội dung nghiên cứu
3.1.5. Kết quả đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên
Sau 4 tuần tạo rễ, khi cây Ngưu tất cao khoảng 5-6cm và có khoảng 6-8 rễ tiến hành đưa cây ra môi trường tự nhiên. Chúng tôi sử dụng ba giá thể là đất mùn (đất có tỷ lệ mùn cao, giữ nước tốt), đất cát (đất có tỷ lệ cát cao, giữ nước kém), đất mùn + trấu hun (1:1) (đất có tỷ lệ mùn cao, khả năng giữ nước trung bình). Theo dõi các chỉ tiêu sau 15 ngày, 30 ngày chăm sóc. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả đưa cây Ngưu tất ra môi trường tự nhiên
Giá thể Tỷ lệ cây sống (%) Màu sắc hình thái cây Chiều cao sau 15 ngày (cm) Chiều cao sau 30 ngày (cm) TĐST (lần) Đất mùn 94,21±0,58 XBT 11,27±0,05 20,08±0,09 1,78 Đất cát 92,46±0,23 vàng 10,05±0,07 17,43±0,12 1,73 Đất mùn+trấu hun (1:1) 95,07±0,15 XBT 12,71±0,08 20,52±0,06 1,84
Qua bảng 3.7 cho thấy, cả ba giá thể cây Ngưu tất đều sống và phát triển được. Trong đó giá thể đất mùn + trấu hun (1:1)cho tỷ lệ sống sót cao nhất là 95,07%, thấp nhất là giá thể đất cát là 92,46%. Tốc độ sinh trưởng khác nhau ở các giá thể, tốt nhất là giá thể đất mùn + trấu hun (cây xanh tốt nhất, tốc độ sinh trưởng đạt 1,84 lần giữa hai lần theo dõi), tốc độ sinh trưởng thấp nhất là giá thể đất cát đạt 1,73 lần, cây có màu vàng. Vậy giá thể tốt nhất cho cây Ngưu tất là đất mùn + trấu hun (1:1). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với điều kiện sống thích hợp của cây Ngưu tất trong tự nhiên là đất phù sa.
Bảng 3.8. Kết quả theo dõi một số chỉ tiêu sau 30 ngày đưa cây ra vườn ươm Đặc điểm so sánh Cây trồng bằng hạt (ĐC) Cây in vitro % so ĐC Chiều cao cây (cm) 30,76±0,14 31,04±0,24 100,91
Đường kính thân
(mm) 3,05±0,06 3,13±0,05 102,62
Số lá/cây 18,68±0,12 18,43±0,16 98,67
Màu sắc, hình thái lá XBT, hình trứng XBT, hình trứng
Chiều dài rễ (cm) 14,92±0,09 15,07±0,27 101,01
Bảng 3.9. Một số chỉ tiêu theo dõi rễ cây in vitro và rễ cây trồng bằng hạt khi thu hoạch
Chỉ tiêu theo dõi Cây trồng bằng hạt Cây in vitro
Chiều dài rễ (cm) 16,02±0,06 15,83±0,08
Đường kính rễ(mm) 7,15±0,07 7,21±0,06
Số rễ cái/cây 2,23±0,12 2,26±0,14
Số rễ con/cây 5,32±0,09 5,21±0,05
Màu sắc rễ nâu nhạt nâu nhạt
Sau khi cây đã được huấn luyện thuần thục trong chậu, ra được 2 lá mới thì tiến hành đưa cây ra vườn ươm. Sau 30 ngày đưa cây ra vườn ươm, chúng tôi tiến hành theo dõi một số chỉ tiêu và so sánh đối chứng với cây Ngưu tất được trồng bằng hạt (thời điểm gieo hạt trùng với thời gian bắt đầu đưa cây ra môi trường tự nhiên) (bảng 3.8). Khi lá Ngưu tất bắt đầu úa vàng thì tiến hành thu hoạch rễ, theo dõi một số chỉ tiêu hình thái nhằm so sánh rễ cây in vitrro
Sample For Means với mức ý nghĩa 0,05 thuộc phần mềm Data analysis để xử lý số liệu thu được. Kết quả so sánh các giá trị trung bình đã xác định được sự khác nhau không có ý nghĩa ở mức α = 0,05 (vì Ttn < Tα) tức các giá trị trung bình không khác nhau với độ tin cậy 95% (bảng phụ 4). Như vậy, các cây được nuôi cấy trong ống nghiệm khi đưa ra ngoài vườn ươm có sự sinh trưởng, phát triển tốt, giống như cây được trồng tự nhiên. Về mặt hình thái rễ cây in vitro không có sự khác biệt so với rễ cây trồng bằng hạt.
Hình 3.10. Một số hình ảnh đưa cây ra môi trường tự nhiên
3.2. Hàm lƣợng saponin tổng số trong rễ cây Ngƣu tất in vitro trồng ngoài đồng ruộng và cây trồng bằng hạt
Trong các yếu tố cấu thành nên chất lượng sản phẩm cây Ngưu tất thì hàm lượng saponin trong rễ là yếu tố quan trọng nhất, là yếu tố quyết định dược tính và giá trị thương phẩm của cây Ngưu tất. Vì vậy, để đánh giá mức độ ổn định của cây in vitro và cây trồng bằng hạt, chúng tôi tiến hành định lượng hợp chất saponin và thực hiện các phản ứng màu định tính.
Kết quả thực hiện các phản ứng định tính (hình 3.11) cho thấy, ở phản ứng Liebermann -Burchard cả hai ống nghiệm đều cho màu cam đỏ và bền vững trong một thời gian dài. Phản ứng trên đã khẳng định rễ cây Ngưu tất in
vitro và rễ cây trồng bằng hạt có chứa hợp chất saponin. Tiến hành phản ứng
Cây Ngưu tất trong phòng cây
Huấn luyện cây in vitro Vườn ươm trước thu hoạch
định tính bột Ngưu tất với dung dịch NaCl 1% cho thấy sự biểu hiện màu và mức độ tạo bọt của hai ống nghiệm là giống nhau (bọt màu vàng bền vững dâng lên 2,5 cm trong ống nghiệm). Như vậy, phản ứng định tính với dung dịch NaCl 1% đã bước đầu khẳng định hàm lượng saponin toàn phần trong rễ cây Ngưu tất in vitro và cây trồng bằng hạt bằng nhau.
Chúng tôi tiến hành tách chiết và định lượng hợp chất saponin toàn phần trong rễ cây Ngưu tất in vitro và cây trồng bằng hạt. Sử dụng hàm t-Test Two Sample For Means với mức ý nghĩa 0,05 thuộc phần mềm Data analysis để xử lý số liệu thu được. Kết quả phân tích cho thấy tất cả các giá trị Ttn < Tα. Như vậy, các giá trị trung bình không khác nhau ở mức ý nghĩa α = 0,05 tức các giá trị trung bình không khác nhau với độ tin cậy 95% (bảng phụ 3). Kết quả trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Hàm lượng hợp chất saponin trong rễ cây in vitro và rễ cây trồng bằng hạt
m (g) p(g) b(g) X (%) X (%) Cây tự nhiên 20,011 0,782 0,000 3,908 3,908±0,021 20,013 0,811 0,000 4,052 20,006 0,753 0,000 3,764 Cây invitro 20,009 0,814 0,000 4,068 3,909±0,019 20,012 0,761 0,000 3,803 20,014 0,772 0,000 3,857
So sánh hàm lượng hợp chất saponin trong rễ cây in vitro và cây trồng bằng hạt chúng tôi nhận thấy, hàm lượng saponin trong rễ cây in vitro không có sự khác biệt so với trong rễ cây trồng bằng hạt. Hàm lượng saponin khoảng 3,9% khối lượng khô. Như vậy, trong quá trình nuôi cấy in vitro không làm thay đổi hàm lượng saponin trong rễ cây Ngưu tất và không làm thay đổi chất lượng sản phẩm so với cây trồng bằng hạt. Tuy nhiên, kết quả theo dõi các chỉ
tiêu của chúng tôi đều nhỏ hơn so với kết quả của một số tác giả khác [32]. Điều này có thể do thời điểm chúng tôi thu hoạch rễ cây sớm hơn 1 tháng so với mùa thu hoạch của rễ cây Ngưu tất.
Hình 3.11. Một số phản ứng định tính hợp chất saponin
Hình 3.12. Hình ảnh một số giai đoạn tách chiết hợp chất saponin
3.3. Sử dụng kĩ thuật RAPD đánh giá hệ gen cây Ngƣu tất in vitro và cây trồng bằng hạt
3.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số
Chúng tôi đã tiến hành tách chiết AND tổng số từ lá non cây Ngưu tất theo Gawel. Dung dịch ADN được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di cho thấy, chỉ có một băng chính tập trung các phân tử ADN có phân tử lớn gần giếng tra mẫu (hình 3.13). ADN tổng số
Cô cạn dịch chiết bằng máy cất quay Loại lipit bằng dụng cụ Soxhlet Tách chiết saponin bằng phễu chiết Chiết saponin bằng dụng cụ soxhlet
được tách chiết từ 5 mẫu cây Ngưu tất tương đối sạch, ít đứt gãy và có thể được sử dụng trong phản ứng RAPD.
NT1: Cây trồng bằng hạt
NT2: cây in vitro trên môi trường BAP 2,5mg/l NT3: cây in vitro trên môi trường kinetin 1,5mg/l
NT4: cây in vitro trên môi trường tổ hợp BAP 2,5mg/l + α-NAA 0,4mg/l NT5: cây in vitro trên môi trường tổ hợp kinetin 1,5mg/l + α-NAA 0,4mg/l
Hình 3.13. Hình ảnh điện di kiểm tra độ tinh sạch ADN
3.3.2. Kết quả phản ứng RAPD
ADN tổng số của 5 mẫu Ngưu tất sau khi được tách chiết và tinh sạch được pha loãng về nồng độ sử dụng khoảng 10-20ng/l. Mẫu ADN được phân tích với 5 mồi ngẫu nhiên. Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC (giá trị PIC càng lớn thì tính đa hình của cặp mồi đó càng cao) và sự xuất hiện các phân đoạn cho tính đa hình khi điện di sản phẩm RAPD.
Số phân đoạn và tần số xuất hiện các phân đoạn ADN
Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhau được điện di trên gel agaroza 1,8% để phân tích tính đa hình ADN của 5 mẫu Ngưu tất nghiên cứu. Ở các
mồi khác nhau, số phân đoạn ADN nhận được có sự khác nhau, dao động từ 6-9 phân đoạn. Tổng số phân đoạn nhận được của 5 mồi với năm mẫu Ngưu tất phân tích là 180. Kết quả thể hiện trên bảng 3.11.
Bảng 3.11. Tổng số phân đoạn ADN xuất hiện của 5 mẫu Ngưu tất khi phân tích với 5 mồi ngẫu nhiên
Mồi NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Tổng phân đoạn
OPF10 6 6 6 6 6 30 OPH04 9 9 9 9 9 45 OPN05 9 9 9 9 9 45 OPP15 6 6 6 6 6 30 OPP19 6 6 6 6 6 30 Tổng 36 36 36 36 36 180
Bảng 3.11 cho thấy, trong số 5 mồi phân tích, số phân đoạn ADN được nhân bản của 5 mẫu Ngưu tất thu được nhiều nhất ở hai mồi: mồi OPH04 và 0PN05 (45 phân đoạn) có 3 mồi có số phân đoạn ADN đươc nhân bản bằng nhau (30 phân đoạn) đó là OPF10, OPP15, OPP19. Tuy nhiên, giữa các mẫu khác nhau số phân đoạn thu được không có sự biến động, tất cả các mẫu đều thu được 36 phân đoạn ADN. Điều này thể hiện sự đồng nhất của các phản ứng PCR cũng như chất lượng ADN của 5 mẫu Ngưu tất.
Tính đa hình của các phân đoạn ADN
Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn khi so sánh giữa các mẫu với nhau trong cùng 1 mồi. Kết quả tổng hợp trên bảng 3.12.
Qua bảng 3.12 cho thấy, tổng số phân đoạn ADN của 5 mẫu Ngưu tất khi phân tích với 5 mồi ngẫu nhiên là 36 phân đoạn. Trong đó, số phân đoạn đa hình là 0 phân đoạn và không đa hình là 36 phân đoạn (chiếm 100%). Các mồi còn lại không nhân được sự đa hình các phân đoạn ADN do vậy tỷ lệ đa hình đều là 0 % (bảng 3.12). Các mồi nghiên cứu được thiết kế dựa trên sự sai khác của các trình tự nucleotit vì vậy từ kết quả đa hình và đơn hình các phân đoạn ADN cho thấy không có sự sai khác về ADN của 5 mẫu Ngưu tất trong nghiên cứu này. Kết quả này cũng phù hợp khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình (giá trị PIC), giá trị PIC của 5 mồi đều bằng 0.
Bảng 3.12. Số phân đoạn ADN đa hình thu được từ 5 mẫu Ngưu tất với từng mồi phân tích
Mồi Tổng số phân đoạn ADN
Số phân đoạn đa hình
Số phân đoạn đơn hình PIC OPF10 6 0 6 0 OPH04 9 0 9 0 OPN05 9 0 9 0 OPP15 6 0 6 0 OPP19 6 0 6 0 Tổng 36 0 30
Với 5 mồi ngẫu nhiên ADN được nhân bản thể hiện rõ thông qua hình ảnh điện di trên gel agarose 1,8%
Mồi OPP15 và OPP19: Quan sát ảnh điện di cho thấy trong vùng phân tích từ 250 bp tới 1500 bp cả hai mồi đều xuất hiện 6 phân đoạn ADN được nhân bản. Tuy nhiên, giữa các mẫu Ngưu tất nghiên cứu không thấy có sự khác biệt về số phân đoạn ADN quan sát được và kích thước của các phân đoạn này cũng hoàn toàn giống nhau (hình 3.14). Như vậy, hai mồi ngẫu nhiên này không cho tính đa hình về ADN của 5 mẫu Ngưu tất nghiên cứu.
Hình 3.14. Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% mồi OPP15 và OPP19
Mồi OPH04 và mồi OPN05:: Tương tự như hai mồi trên, mồi OPH04 và mồi OPN05 không cho tính đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản. Cụ thể, mồi OPH04 trong phạm vi vùng phân tích số phân đoạn ADN được nhân lên là 9 phân đoạn với kích thước khoảng 250-1500bp. Mồi OPN05 nhân được 9 phân đoạn với kích thước dao động lớn 250 – 3000bp (hình 3.15). Cả hai mồi đều không có sự khác biệt về số phân đoạn và kích thước phân đoạn ADN được nhân lên giữa các mẫu Ngưu tất sử dụng.
Hình 3.15. Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% mồi OPH04 và OPN05
NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 M NT1 NT2 NT3 NT4 NT5
1500bp
250bp
Mồi OPF10: Không cho thấy tình đa hình các phân đoạn ADN được nhân bản. Trong phạm vi vùng phân tích cả 5 mẫu Ngưu tất đều xuất hiện 6 phân đoạn ADN với kích thước tương đương nhau nằm trong khoảng 250 tới 1200 bp (hình 3.16).
Hình 3.16. Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% mồi OPF10 Kết quả phản ứng RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên bước đầu cho thấy không có sự xuất hiện phân đoạn cho tính đa hình. Điều đó chứng tỏ, hệ gen của cây in vitro không có sự thay đổi so với hệ gen của cây trồng bằng hạt. Như vậy, môi trường chúng tôi sử dụng nuôi cấy in vitro đảm bảo sự ổn định hệ gen của cây in vitro và có thể sử dụng để nhân nhanh cây Ngưu tất.
M NT1 NT2 NT3 NT4 NT5
OPF10
250bp 1000bp
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Công thức khử trùng hạt Ngưu tất là: Hạt được tráng sạch 5 lần bằng nước cất khử trùng, tráng trong dung dịch ethanol 70% trong 45 giây, sau đó cho hạt ngâm trong dung dịch javen 60%, lắc đều trong 15 phút và rửa sạch hạt 5 lần bằng nước cất khử trùng trước khi cấy lên môi trường.
2. Môi trường thích hợp cho nhân nhanh Ngưu tất là:
MS cơ bản + kinetin 1,5mg/l + α-NAA 0,4mg/l + 9,0g aga + 200ml nước dừa + 30g saccharose + 2g than hoạt tính.
3. Kết quả đưa cây Ngưu tất ra môi trường tự nhiên: giá thể tốt nhất cho cây Ngưu tất là đất mùn + trấu hun (1:1). Các cây in vitro có sự sinh trưởng phát triển tốt, các đặc điểm hình thái không có gì khác biệt so với cây trồng tự nhiên khi đưa ra vườn ươm. Khi thu hoạch, rễ cây in vitro có đặc điểm hình thái giống như rễ cây trồng bằng hạt.
4. Không có sự thay đổi hàm lượng saponin tổng số trong rễ cây in vitro và rễ cây trồng bằng hạt. Hàm lượng saponin khoảng 3,9% khối lượng khô.
5. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên như sau: trong phạm vi vùng phân tích có 36 phân đoạn ADN được nhân bản và không có phân đoạn cho tính đa hình, số lượng phân đoạn được nhân bản của các mồi dao động từ 6 đến 9 phân đoạn. Như vậy, không xuất hiện sự sai khác về ADN giữa cây trồng bằng hạt và cây nuôi cấy in vitro.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1. Nguyễn Thái An (2008) "Nghiên cứu thành phần saponin và tinh dầu của các vị thuốc trong phương tiêu giao tán" Tạp chí Dược học, số 389, tr.27-30. 2. Nguyễn Thế Anh, Trần Văn Minh (2007), “Vi nhân giống cây Pơmu (Forkienia hodginsii (Dunn) A. Henry & H. H Thomas)”, Những vấn đề
nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr.647-647
3. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội.
4. Nguyễn Việt Cường, Phạm Đức Tuấn (2007), “Ứng dụng chỉ thị phân tử (RAPD và ADN lục lạp) trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xây dựng vườn cóc hành”, Tạp chí NN&PTNT, số 19, tr.69-75.
5. Mai Đăng Đẩu (2005), “Nghiên cứu, thiết kế, chế tạo hệ thống thiết bị chiết xuất dược liệu và hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất saponin từ Ngưu tất”. Tạp chí Công Nghệ Sinh học, số 35, tr.25-31.
6. Lê Xuân Đắc, Lê Thị Xuân, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình và CS (2004), "Nhân nhanh và bảo tồn cây màng tang (Litsea verticiliata) được tìm thấy ở vườn Quốc gia Cúc Phương bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật". Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(4) tr. 479-486.
7. Trần Văn Định, Trần Văn Minh (2007), “Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong bảo tồn và phát triển nguồn gen cây thông đỏ (Taxus Wallichiana Zucc.)”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT Hà Nội, tr. 689-691.
8. Phạm Văn Hiển, Vũ Hoài Sâm, Nguyễn Trần Hy (2005), “Sử dụng công nghệ tế bào thực vật để phục tráng, nhân nhanh và xây dựng hệ thống sản xuất giống Ba Kích và Ngưu tất”. Tạp chí Công Nghệ Sinh học, số 48, tr.356-362.
9. Nguyễn Văn Lan, Trịnh An Vĩnh (1976), Kĩ thuật trồng một số cây dược liệu, tập 2, Nxb Nông nghiệp.
10. Nguyễn Phú Lịch, Nguyễn Thị Tâm, Lê Ngọc Công (2007), « Bước đầu nghiên cứu nhân giống thanh hao hoa vàng (Artemisia annual L.) bằng kỹ