3. Ý nghĩa thực tiễn của ựề tài
2.7.2. Tiến hành phản ứng
Bước 1: Tách chiết RNA
- Cho dung dịch Trizol vào mẫu và bảo quản ở tủ lạnh âm 80oC qua ựêm. - Thêm lượng tương ứng Chloroform vào các ống mẫu, trộn ựều bằng máy vortex và ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 3 phút.
- Ly tâm lấy phần dịch trong phắa trên ựể vào ống Eppendorf 1,5 ml free Ranse/Dnase.
Bước 2: Tủa RNA
- Thêm dung dịch Iso -Propanol vào các ống chứa dịch trong ở trên, trộn ựều bằng vortex.
- để mẫu dung dịch ở 300C trong 10 phút.
Bước 3: Rửa cặn
- Cho vào mỗi ống 750 ộl dung dịch Ethanol 70% vào các ống ở trên. - Ly tâm 9000 vòng /phút trong 5 phút ở 40C.
- Loại bỏ hết cồn, thu cặn RNA.
- Rửa cặn RNA lần 2 giống lần 1 nhưng dùng cồn etanol 96% - Spin lại, dùng pipette loại bỏ cồn ựến giọt cuối cùng.
- Mở nắp Eppendorf ựể hong khô RNA trong 15 phút ở nhiệt ựộ phòng. - Hoà tan cặn RNA trong 50 ộl nuclease-free-water bằng pipette và vortex. - Giữ RNA trên ựá lạnh nếu dùng ngay, hoặc bảo quản ở -200C cho ựến khi sử dụng.
Bước 4: Tổng hợp cDNA - Phản ứng Reverse Transcription
- Phản ứng PCR chỉ khuếch ựại DNA nên RNA phải qua quá trình dịch mã từ RNA sang cDNA nhờ men sao chép ngược (Reverse Trancriptase).
Nguyên liệu: dung dịch DEPC, Random primer, RNA của từng mẫu RNA thu ựược.
Cho hỗn hợp vừa pha này vào máy Thermocycler ựặt 700C trong 5 phút, sau ựó ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 10 phút.
Pha tiếp hỗn hợp trên trong ống 1 Eppendorf 0,2 ml với: DEPC treated water, RT buffer, DTT 0.1M, dNTP 10mM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Reverse transcription. (Lan et al, 2005).
để hỗn hợp ở nhiệt ựộ phòng trong 5 phút, sau ựó cho vào tủ ấm 370C trong 40 phút.
- Thành phần của phản ứng PCR: Nước cất, PCR 10x buffer, MgCl2,
dNTPs, Primer 1 (Reverse), Primer 2 (Forward), Taq DNA Polymerase, cDNA ựã tổng hợp.
Bảng 2.1. Chu trình nhiệt RT-PCR
Giai ựoạn Tên bước tổng hợp Nhiệt ựộ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Duỗi mạch 94 30 phút 1
Duỗi mạch 95 30 giây
Gắn mồi 54 30 giây
2
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
30
3 Hoàn chỉnh 72 5 phút 1
4 Dừng 4 Bảo quản