CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Quy trình chuẩn bị ruồi giấm phục vụ nghiên cứu
2.2.1.1. Nhân dòng ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson và dòng chứng sinh lý phục vụ nghiên cứu
Tiến hành lai với tỷ lệ đực cái (1:1) các cặp ruồi bố mẹ, thực hiện phép lai di truyền theo sơ đồ sau:
Phép lai 1: tạo dòng đối chứng sinh lý
P: ♀ elav-GAL4 X ♂ UAS-GFP-CD8 (tỷ lệ 1:1)
F1: 𝐞𝐥𝐚𝐯−𝐆𝐀𝐋𝟒
𝐔𝐀𝐒−𝐆𝐅𝐏−𝐂𝐃𝟖
Kí hiệu: elav-GFP
Phép lai 2: tạo dòng bệnh Parkinson biểu hiện protein α-synuclein
P: ♀ elav-GAL4 X ♂ UAS-SNCA (tỷ lệ 1:1)
F1: 𝐞𝐥𝐚𝐯−𝐆𝐀𝐋𝟒
𝐔𝐀𝐒−𝑺𝑵𝑪𝑨
20
Ruồi giấm được nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản. Thức ăn cho ruồi được thay 3 ngày một lần, đảm bảo cung cấp nguồn dinh dưỡng đầy đủ cho ruồi đến khi làm thí nghiệm. Tất cả các ruồi mang gen nghiên cứu được ni trong phịng thí nghiệm ở nhiệt độ 25 ± 1oC với chu kỳ 12 giờ sáng – 12 giờ tối (sáng từ 7 giờ đến 19 giờ). Các thí nghiệm đánh giá hành vi được thực hiện trong giai đoạn sáng từ 9 giờ đến 18 giờ.
2.2.1.2. Thức ăn cho ruồi giấm
Môi trường thức ăn cơ bản cho ruồi giấm bao gồm các thành phần sau: đường saccarose (5% w/v), nấm men (5% w/v), sữa bột (3% w/v), agar (1% w/v), acid propionic (0.5% v/v) và natri benzoat (1% v/v).
2.2.1.3. Quy trình chuẩn bị thu ấu trùng và ruồi trưởng thành phục vụ nghiên cứu
- Đối với ấu trùng: Ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu. Để ruồi đẻ trứng (2-3 ngày) trong ống thức ăn chứa mẫu, sau đó chuyển tồn bộ ruồi bố mẹ ra khỏi ống thức ăn sang ống mới. Tiến hành thu ấu trùng giai đoạn thích hợp phục vụ cho thí nghiệm
- Đối với ruồi trưởng thành: Ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu. Để ruồi đẻ trứng (2-3 ngày) trong ống thức ăn chứa mẫu, sau đó chuyển tồn bộ ruồi bố mẹ ra khỏi ống thức ăn sang ống mới. Ấu trùng nở và đóng kén sau 6-8 ngày, theo dõi ngày nở của kén, thu cá thể ruồi F1 mới nở, chuyển sang ống thức ăn có mẫu nghiên cứu mới. Các cá thể ruồi F1 này phục vụ cho thí nghiệm ở các thời điểm thích hợp
2.2.1.4. Chia lơ thí nghiệm
Chia ruồi đã thu được ở trên làm 04 lô nghiên cứu:
Lơ 1: Nhóm chứng sinh lý sử dụng dòng elav-GFP + nuôi trong ống thức ăn chuẩn
Lơ 2: Nhóm chứng bệnh lý sử dụng dịng elav-SNCA + ni trong ống thức ăn chuẩn
Lơ 3: Nhóm mẫu sử dụng dịng ruồi elav-SNCA + nuôi trong ống thức ăn chuẩn có bổ sung GCL ở nồng độ 2 mg/ml
Lơ 4: Nhóm mẫu sử dụng dịng ruồi elav-SNCA + ni trong ống thức ăn chuẩn có bổ sung GCL ở nồng độ 4 mg/ml
Tiến hành thí nghiệm đồng thời trên 4 lơ với các thử nghiệm đánh giá tác dụng cải thiện hành vi và đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo trên đầu ruồi giấm.
21