CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của cao chiết ethanol từ Giảo cổ lam (GCL)
trên mơ hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Parkinson
2.2.3.1. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro của cao chiết ethanol từ GCL
Khảo sát khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH dựa trên mô tả trong nghiên cứu của tác giả Brand Williams và cộng sự (1995) [16]. Chúng tơi tiến hành thí nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro của cao chiết ethanol từ GCL.
Nguyên lý: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu
tím, phân tử khơng bị dimer hóa như một số gốc tự do khác và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 517nm. Khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ bị khử để hình thành 2,2- Diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H) có màu vàng (màu của nhóm picryl), làm giảm độ hấp thụ của các gốc tự do DPPH (mô tả ở Hình 2.5). Đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa.
Hình 2.6. Phản ứng giữa DPPH và một chất chống oxy hóa
Quy trình thí nghiệm:
Bước 1: Pha dung dịch DPPH gốc 5 mM: Cân chính xác 9,858 mg bột DPPH cho
vào ống eppendorff 15 mL, thêm 5 mL MeOH, lắc đến tan hoàn toàn trên máy vortex.
Bước 2: Pha dung dịch DPPH nồng độ 0,5 mM: Hút 1 mL dung dịch DPPH gốc
(bước 1) vào 1 ống falcon 15 ml mới, dùng micropipet thêm vào 9 mL MeOH, lắc đều.
Bước 3: Pha dãy dung dịch mẫu cao chiết ethanol từ GCL có nồng độ từ 0,1 mg/ml
đến 1,0 mg/ml.
28
Bước 4: Thêm vào từng giếng của đĩa phản ứng 90 µL dung dịch DPPH 0,5 mM
và 10 µL mẫu thử cao chiết ethanol từ GCL ở từng nồng độ. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Tiến hành làm song song với mẫu trắng chứa: 90 µL dung dịch DPPH và 10 µL methanol. Đậy kín đĩa, tránh ánh sáng, cho phản ứng tiến hành ở nhiệt độ phòng trong 30 phút rồi đem đo độ hấp thụ quang ở 517 nm.
Cách tính kết quả:
- Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của cao chiết ethanol từ GCL được tính theo cơng thức sau:
% ức chế = ODmẫu trắng − ODmẫu thử
ODmẫu trắng
Trong đó: ODmẫu trắng là độ hấp thụ quang của mẫu trắng ODmẫu thử là độ hấp thụ quang của mẫu thử
- Từ đó tính được giá trị IC50 của cao chiết thơng qua phương trình hồi quy tuyến tính.
2.2.3.2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa bằng thử nghiệm ex vivo trên dịch đồng thể đầu ruồi giấm
Quy trình thu dịch đồng thể đầu ruồi tiến hành như sau: - Ruồi được chuẩn bị làm 4 nhóm:
Ruồi sinh lý: elav-GFP
Ruồi bệnh lý Parkinson (ruồi chuyển gen SNCA biểu hiện protein alpha-
synuclein): elav-SNCA
Ruồi bệnh Parkinson sử dụng mẫu cao chiết ethanol từ GCL ở nồng độ 2 mg/ml: GCL-2
Ruồi bệnh Parkinson sử dụng mẫu cao chiết ethanol từ GCL ở nồng độ 4 mg/ml: GCL-4
- Mỗi lô gồm 20 con: 10 đực và 10 cái ruồi trưởng thành (3 ngày tuổi). Quy trình tách đầu ruồi giấm làm phản ứng oxy hóa:
Bước 1: Cho 120 µl PBS 1X vào mỗi ống eppendorf 1,5 mL để trên đá, ghi nhãn
từng nhóm rõ ràng.
Bước 2: Tách đầu ruồi (10 đực + 10 cái) ruồi trưởng thành (3 ngày tuổi) cho vào
ống eppendorf 1,5 mL tương ứng với từng nhóm.
Bước 3: Nghiền bằng chày trong 5 phút (đồng nhất). Bước 4: Ly tâm nhẹ với lực 800g ở - 4oC trong 10 phút
29
Bước 5: Hút 80 µl dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5 mL mới, ghi nhãn. Bước 6: Bảo quản ống ở -20oC trước khi làm phản ứng.
Phương pháp đánh giá hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH
Quy trình thí nghiệm:
- Tiến hành tương tự phản ứng DPPH in vitro, dung dịch DPPH chuẩn bị cho phản ứng có nồng độ 0,25 mM trong MeOH. Mẫu nghiên cứu được thay bằng dịch đồng thể đầu ruồi.
Trên đĩa 96 giếng gồm:
(1) Giếng trắng (chỉ chứa dung mơi, khơng có mẫu nghiên cứu - Solvent): 10 µL đệm PBS 1X và 90 µL MeOH (để hòa tan DPPH).
(2) Giếng chuẩn đối chiếu (DPPH): 10 µL đệm PBS 1X và 90 µL DPPH.
(3) Giếng mẫu trắng (có chứa mẫu nghiên cứu - sample blank): 10 µL dịch đồng thể đầu ruồi và 90 µL MeOH.
(4) Giếng phản ứng (Sample + DPPH): 10 µL dịch đồng thể đầu ruồi và 90 µL DPPH.
- Mỗi lơ lặp lại 3 lần. Đĩa được bọc kín, tránh ánh sáng, sau 30 phút tiến hành đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 517 nm.
Cách tính kết quả:
- Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH được biểu thị bằng công thức sau:
% ức chế = 100% −[OD(4)− OD(3)]
[OD(2)− OD(1)]
Trong đó: ODSample+DPPH là độ hấp thụ quang mẫu (4). ODSample Blank là độ hấp thụ của mẫu (3). ODDPPH là độ hấp thụ của mẫu (2).
ODSolvent là độ hấp thụ quang của mẫu (1).
Phương pháp định lượng MDA (Malondialdehyd)
Sự peroxy hóa lipid được xác định bằng phương pháp TBARS (Thiobarbituric acid (TBA) reactive substances - chất phản ứng thiobarbituric acid).
Phương pháp định lượng MDA dựa trên mô tả trong nghiên cứu của tác giả Subedi và cộng sự (2017) [72].
Nguyên lý: MDA (Malondialdehyd) là sản phẩm cuối cùng của q trình peroxy
hóa lipid màng tế bào gây ra bởi các gốc tự do. MDA có thể phản ứng với TBA để tạo thành phức màu đỏ son hấp thụ cực đại ở bước sóng 532 nm được mơ phỏng ở Hình
30
2.6. Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 532 nm cho phép tính được nồng độ của MDA
trong mẫu.
Hình 2.7. Phản ứng giữa MDA và TBA
Quy trình thí nghiệm:
- Chuẩn bị dung dịch TBA 0,37% (trong 10 mL HCl 0,24N chứa 0,037 g TBA và TCA 15%)
- Tiến hành phản ứng:
+ Giếng phản ứng: 90 µL dung dịch TBA 0,37% và 10 µL dịch đồng thể đầu ruồi. + Giếng trắng: 90 µL dung dịch TBA 0,37% và 10 µL dung dịch PBS 1X.
- Mỗi lô lặp lại 3 lần. Đĩa phản ứng được đậy nắp kín, ủ trong tủ sấy ở 100⁰C trong 15 phút cho phản ứng. Đem đo quang ở bước sóng 532 nm.
Cách tính kết quả:
- Nồng độ của MDA trong các lơ được tính dựa theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA (Phụ lục 1). Chất chuẩn MDA: 1,1,3,3-tetraethoxypropan.