CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Phương pháp đánh giá
2.3.2.1. Phương pháp đánh giá một số đặc tính nguyên liệu
a. Đánh giá một số đặc tính dược chất
1) Hình dạng tiểu phân: xác định bằng kính hiển vi quang học.
2) Kích thước: xác định KTTP bằng kính hiển vi quang học, cùng với trắc vi vật
kính có chia vạch, độ chia nhỏ nhất có kích thước 10 μm. Phân tán vi hạt đã bào chế vào dầu paraffin. Chụp hình ảnh qua kính hiển vi bằng điện thoại Vsmart Joy 4 độ phân giải 16 megapixel và sử dụng phần mềm xử lý hình ảnh ImageJ (phát triển tại: “National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation” (Đại học Wisconsin)) để đo ngẫu nhiên kích thước của 100 vi hạt.
3) Đánh giá độ đắng của cefuroxim axetil bằng chất chuẩn quinin
Theo Dược điển châu Âu [14], độ đắng của một chất có giá trị bằng số mL nước cất lớn nhất dùng để hòa tan 1 g chất đó thành dung dịch cịn có vị đắng. Quinin có độ đắng là 200000, là một chất rất đắng, vì thế người ta chọn quinin làm chất chuẩn để thử độ đắng cho các chất khác.
Cách tiến hành: cần 6 tình nguyện viên để xác định độ đắng của dược chất.
Tìm hệ số hiệu chỉnh cá nhân: để khắc phục sự khác nhau về cảm nhận vị đắng
giữa các tình nguyện viên, cần xác định một hệ số hiệu chỉnh cho từng tình nguyện viên. Cân chính xác một lượng 0,01 g quinin hydroclorid hịa tan trong 1000 mL nước cất thu được dung dịch A. Lấy 4,2; 4,4; 4,6; 4,8; 5,0; 5,2; 5,4; 5,6; 5,8 mL dung dịch A cho vào các bình định mức 10 mL, bổ sung nước cất vừa đủ được các dung dịch thử. Cho lần lượt 10 mL các dung dịch thử có nồng độ từ thấp đến cao vào giữa lưỡi của tình nguyện viên, ngậm trong 30 giây sau đó nhổ ra và ghi lại cảm nhận về vị đắng (đắng hoặc không đắng). Sau mỗi lần thử, súc miệng sạch và chờ 10 phút để thử dung dịch tiếp theo. Hệ số hiệu chỉnh cho mỗi tình nguyện viên được tính theo cơng thức: K= n
5 Trong đó: K là hệ số hiệu chỉnh cá thể; n là số mL dung dịch A nhỏ nhất dùng để pha dung dịch thử có vị đắng.
Xác định độ đắng của CFA: cân chính xác khoảng 0,1 g CFA, hịa tan trong 1000
20
bình định mức 10 mL, thêm nước cất vừa đủ được các dung dịch thử. Cho lần lượt 10 mL các dung dịch thử có nồng độ từ thấp đến cao vào giữa lưỡi của tình nguyện viên, ngậm trong 30 giây sau đó nhổ ra và ghi lại cảm nhận về vị đắng (đắng hoặc không đắng). Sau mỗi lần thử, súc miệng sạch và chờ 10 phút để thử dung dịch tiếp theo. Độ đắng của dược chất được tính theo cơng thức: B = 100000×KX
Trong đó: B là độ đắng của dược chất; K là hệ số hiệu chỉnh cá thể; X là số mL dung dịch B nhỏ nhất dùng để pha dung dịch thử có vị đắng.
Từ độ đắng của nguyên liệu sẽ tính được nồng độ nhỏ nhất mà ở đó CFA cịn có vị đắng, nồng độ này được gọi là ngưỡng đắng.
4) Nồng độ cefuroxim axetil trong môi trường phân tán sau khi pha thành hỗn dịch: thực hiện theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.2.2.
5) Độ hịa tan của dược chất: thực hiện theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.2.2.
b. Đánh giá một số đặc tính của chất mang
1) Tính thấm của acid stearic trong các môi trường pH: xác định qua góc tiếp
xúc của SA với các mơi trường thử ĐHT. Đun chảy hoàn toàn chất mang SA, dàn thành màng mỏng, để nguội cho SA đông đặc. Nhỏ 2 giọt dung dịch đệm pH 1,2; pH 4,5 ; pH 7,0 lên bề mặt SA. Để yên 30 giây, chụp ảnh và sử dụng tính năng đo góc tiếp xúc (contact angle) qua phần mềm ImageJ để xác định góc tiếp xúc. Góc tiếp xúc tại mỗi pH tiến hành đo 10 lần [38].
2) Độ hòa tan của chất mang acid stearic: thực hiện theo mô tả ở phụ lục 2.
2.3.2.2. Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu của chế phẩm đối chiếu, vi hạt bào chế và bột pha hỗn dịch uống
a. Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm đối chiếu và vi
hạt bào chế
1) Tính chất: đánh giá bằng cảm quan.
2) Đánh giá kích thước tiểu phân: thực hiện theo phương pháp được trình bày
ở mục 2.3.2.1 phương pháp đánh giá đặc tính nguyên liệu.
3) Phương pháp định lượng
Mẫu thử: cân chính xác một lượng chế phẩm tương ứng với khoảng 150,0 mg
CFA cho vào bình định mức 25 mL. Thêm khoảng 20 mL MeOH vào bình. Siêu âm trong 30 phút. Bổ sung MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều thu được dung dịch A. Hút chính xác 1,0 mL dụng dịch A vào bình định mức 50 mL, bổ sung đệm pH 1,2; 4,5; 7,0 vừa đủ đến vạch, lắc đều thu được dung dịch B. Hút chính xác 5 mL dung dịch B vào bình định mức 50 mL, bổ sung mơi trường đệm pH 1,2; 4,5; 7,0 đến vạch, lắc đều. Lọc hỗn hợp qua màng lọc 0,45 μm, bỏ 20 – 30 mL dịch lọc đầu [7].
21
Mẫu chuẩn: cân chính xác một lượng dược chất khoảng 150,0 mg CFA và tiến
hành làm tương tự mẫu thử.
Mẫu trắng: dung dịch đệm pH 1,2; pH 4,5, pH 7,0.
Đo mật độ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn ở bước sóng 281 nm.
4) Thẩm định phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại để định lượng cefuroxim axetil trong chế phẩm
- Tính đặc hiệu
Chuẩn bị các dung dịch:
Dung dịch tá dược (P): được chuẩn bị từ hỗn hợp các tá dược với tỷ lệ bằng nhau,
được pha chế đến nồng độ giả định của mỗi tá dược đều chính xác khoảng 72 μg/mL. Dung dịch thử (T): gồm có CFA và các tá dược với tỷ lệ bằng nhau, nồng độ
CFA chính xác khoảng 12 μg/mL, nồng độ tá dược bằng nồng độ trong dung dịch tá dược (P).
Mẫu trắng (O): dung dịch đệm pH 1,2; pH 4,5; pH 7,0.
Tiến hành: đo độ hấp thụ của các dung dịch (P), (T) tại bước sóng 281 nm. Yêu cầu: tá dược được đánh giá là không ảnh hưởng đến độ hấp thụ của dược chất nếu giá trị độ hấp thụ của dung dịch (P) không quá 2 % so với mẫu (T).
- Tính tuyến tính
Pha dãy dung dịch chuẩn từ dược chất CFA có nồng độ lần lượt chính xác khoảng 1,2; 3,6; 6; 9; 12; 15; 18 µg/mL trong mơi trường đệm pH 1,2; 4,5; 7,0. Đo độ hấp thụ của các dung dịch này ở bước sóng 281 nm; mẫu trắng là mơi trường đệm pH 1,2; 4,5; 7,0. Xây dựng mơ hình tuyến tính biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ (A) và nồng độ dung dịch (C).
u cầu: mơ hình tuyến tính phù hợp nếu hệ số tương quan (r2) lớn hơn 0,996.
- Độ đúng
Chuẩn bị 3 loại mẫu tự tạo T1, T2, T3 có hàm lượng dược chất chính xác biết trước (120 mg; 150 mg; 180 mg). Pha loãng bằng dung dịch đệm tương ứng trong pH 1,2; pH 4,5; pH 7,0 đến nồng độ dược chất thích hợp (nằm trong khoảng tuyến tính đã xây dựng được), định lượng dược chất trong các mẫu, xác định tỷ lệ thu hồi. Với từng loại mẫu, định lượng lặp lại 3 lần.
Yêu cầu: phương pháp được đánh giá là đạt độ đúng nếu tỷ lệ thu hồi trung bình của mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng 98,0 – 102,0 % và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) không quá 2,0 %.
- Độ lặp lại
Định lượng dược chất trong mẫu tự tạo T2, thực hiện lặp lại 6 lần liên tiếp, xác định độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả định lượng.
22
Yêu cầu: phương pháp đánh giá được đánh giá là đạt độ lặp lại nếu độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các kết quả định lượng khơng q 2,0 %.
- Độ chính xác trung gian
Thực hiện như phương pháp ở phần đánh giá độ lặp lại, thực hiện ở 2 ngày khác nhau. Xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các kết quả định lượng và so sánh 2 giá trị kết quả trung bình.
Yêu cầu: phương pháp được đánh giá là đạt độ chính xác trung gian nếu độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các kết quả định lượng ở mỗi ngày không quá 2,0 % và giá trị kết quả trung bình của 2 ngày khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa α = 0,05.
5) Phương pháp đánh giá nồng độ cefuroxim axetil trong môi trường phân tán sau khi pha thành hỗn dịch
Chuẩn bị các mẫu sau:
Mẫu thử: lấy một lượng vi hạt tương ứng với khoảng 150 mg CFA rồi cho vào
cốc có mỏ, thêm 10 mL mơi trường phân tán nước cất và khuấy trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, lọc qua màng lọc 0,45 μm và pha loãng dịch lọc bằng dung dịch đệm phosphat pH 7,0 đến nồng độ thích hợp (trong khoảng tuyến tính), đo độ hấp thụ ở bước sóng 281 nm, mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat pH 7,0.
Mẫu chuẩn: thực hiện giống phần định lượng đã mô tả ở mục 2.3.2.2. Mẫu trắng: dung dịch đệm phosphat pH 7,0.
Đo mật độ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn ở bước sóng 281 nm. Nồng độ CFA giải phóng từ vi hạt trong MTPT:
C =AtìCcìDt
Ac (àg/mL)
Trong đó: C là nồng độ CFA giải phóng từ vi hạt trong MTPT (µg/mL); At, Ac lần lượt là mật độ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn; Cc là nồng độ CFA trong mẫu chuẩn (µg/mL); Dt là độ pha lỗng của mẫu thử.
Nếu nồng độ CFA trong MTPT sau khi pha thành hỗn dịch nhỏ hơn ngưỡng đắng thì mẫu đó được coi là có khả năng che vị hồn tồn [16].
6) Phương pháp đánh giá độ hòa tan của chế phẩm bào chế, chế phẩm đối chiếu và đánh giá sự tương đồng của hai đồ thị hòa tan
Phương pháp đánh giá ĐHT của CPĐC và mẫu nghiên cứu được tham khảo từ chuyên luận “Cefuroxim axetil for oral suspension” của USP 43 [37] và chuyên luận “Bột pha hỗn dịch Cefuroxim” của Dược điển Việt Nam V [4] với các thơng số kỹ thuật:
- Thiết bị hịa tan kiểu cánh khuấy, tốc độ khuấy: 50 vòng/phút.
- Mơi trường thử hịa tan: mỗi cơng thức được đánh giá độ hịa tan trong 900 mL song song tại 3 môi trường: đệm phosphat pH 7,0, acid HCl pH 1,2, đệm citrat pH 4,5.
23 - Nhiệt độ: 37 ± 0,5 °C.
- Thời điểm lấy mẫu: lấy mẫu ít nhất tại 7 thời điểm: 5 phút; 10 phút; 15 phút; 20 phút; 30 phút; 45 phút; 60 phút (thời điểm lấy mẫu 5 phút; 10 phút; 15 phút; 20 phút;, 45 phút, 60 phút là thời điểm được bổ sung thêm so với USP 43 và DĐVN V).
Tiến hành: cân chính xác một lượng vi hạt tương ứng với khoảng 150,0 mg CFA vào cốc có mỏ, thêm vào 10 mL môi trường phân tán pH 7,0, khuấy đều trong 1 phút, sau đó cho vào bình thử hịa tan chứa mơi trường đã được điều nhiệt, tráng rửa cốc có mỏ 3 – 4 lần bằng mơi trường thử hịa tan cho đến khi sạch vi hạt trong cốc. Vận hành thiết bị với các thông số nêu trên, lấy mẫu ở các thời điểm đã định, mỗi lần hút chính xác 10 mL mơi trường thử hịa tan, lọc và pha lỗng đến nồng độ thích hợp (trong khoảng tuyến tính), đo độ hấp thụ ở bước sóng 281 nm, mẫu trắng là dung mơi thử hịa tan, tính lượng dược chất đã hịa tan tại mỗi thời điểm bằng phương pháp so sánh điểm với mẫu chuẩn. Sau mỗi lần lấy mẫu, bổ sung lại 10 mL mơi trường vào bình thử độ hịa tan. Mẫu chuẩn: thực hiện theo phương pháp được trình bày ở phần định lượng.
Nồng độ CFA ở lần hút thứ n:
Cn= Cc×At
Ac ìfn+Vìni=1Ci-1
V0 (àg/mL) T l CFA gii phóng ở thời điểm thứ n:
Qn= Cn×V0
mcân×HL×100 (%)
Trong đó: Cn là nồng độ CFA ở lần hút thứ n; Cc là nồng độ dung dịch CFA chuẩn (µg/mL); At , Ac lần lượt là mật độ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn; fn là hệ số pha lỗng; V là thể tích lấy ra ở mỗi thời điểm lấy mẫu (10 mL); V0 là thể tích mơi trường thử hịa tan (900 mL); Qn là tỷ lệ CFA giải phóng ở thời điểm thứ n; mcân là khối lượng vi hạt đem thử hòa tan; HL là hàm lượng CFA trong vi hạt.
Yêu cầu ĐHT: khơng nhỏ hơn 60% lượng cefuroxim được hịa tan trong môi
trường pH 7,0 sau 30 phút.
Đánh giá sự tương đồng của hai đồ thị hịa tan: thực hiện như mơ tả ở phụ lục 2. Mục tiêu: đồ thị hòa tan của chế phẩm tương đồng với CPĐC và đo lường được
giá trị f2 ≥ 50 tại 3 môi trường pH 1,2; pH 4,5; pH 7,0.
7) Phương pháp xác định mơ hình động học
Sử dụng công cụ DDSolver 1.0, là Add-in của MS Excel, để phân tích dữ liệu hịa tan của các mẫu vi hạt theo mơ hình động học khác nhau như: mơ hình bậc 0, bậc 1, Higuchi, Hixson - Crowell, Korsmeyer - Peppas…
Căn cứ vào giá trị AIC, để xác định mơ hình giải phóng dược chất phù hợp nhất với dạng bào chế, mơ hình giải phóng dược chất phù hợp nhất có giá trị AIC nhỏ nhất [15].
24
8) Đánh giá định tính độ ổn định của vi hạt bào chế được: thực hiện theo
phương pháp TLC được trình bày trong phụ lục 5.
9) Đánh giá tương tác giữa các tá dược và dược chất trong vi hạt
Thực hiện đánh giá thông qua phổ hồng ngoại (FT-IR): lấy khoảng 1 - 2 mg mẫu nghiên cứu trộn với KBr. Khi được hỗn hợp đồng nhất đem dập thành màng mỏng có đường kính 13 mm, lực dập 800MPa. Tiến hành quét phổ với mảng mỏng thu được.
b. Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của bột pha hỗn dịch bào chế được
1) Độ ẩm: xác định bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô trên cân xác
định độ ẩm nhanh OHAUS. Bột được phân tán với khối lượng khoảng 1,0 g, nhiệt độ sấy 105 – 110 °C, thời gian: tự động.
2) Độ trơn chảy: chỉ số Carr (CI) biểu thị cho khả năng trơn chảy của vi hạt/cốm,
được tính theo cơng thức [1]: CI= Vthơ-Vgõ
Vthơ ×100 (%)
Trong đó: Vthơ là thể tích vi hạt/cốm trước gõ; Vgõ là thể tích vi hạt/cốm sau gõ.
Bảng 2.6. Tương quan giữa chỉ số Carr và độ trơn chảy [1]
Chỉ số Carr (%) Phân loại độ trơn chảy
<10 Rất tốt 11-15 Tốt 16-20 Khá 21-25 Trung bình 26-31 Kém 32-37 Rất kém >38 Rất, rất kém
3) pH: một lượng vi hạt tương đương với 150,0 mg CFA chuyển vào cốc có mỏ,
thêm 10 mL MTPT và khuấy trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Đo pH của hỗn dịch tạo thành.
4) Định lượng, pH và nồng độ sau khi phân tán thành hỗn dịch, độ hịa tan, mơ hình động học: đánh giá như mục 2.3.2.2 a (đánh giá một số chỉ tiêu của CPĐC
và vi hạt bào chế).