CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.2. Kết quả khảo sát và lựa chọn điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất
3.2.2. Kết quả xây dựng mơ hình
Từ kết quả thu được ở bảng 3.2, tiến hành xây dựng các phương trình hồi quy đa biến bậc 2, biểu diễn sự phụ thuộc của hàm lượng apigenin (Y1) và hàm lượng luteolin (Y2) vào các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất như thời gian chiết (X1), nồng độ β-CD trong dung môi (X2), tỷ lệ dung môi/ dược liệu (X3). Các biến độc lập X có hệ số với giá trị
25
p < 0,05, ảnh hưởng đến giá trị biến phụ thuộc Y. Ngược lại, những biến có hệ số với giá trị p > 0,05 sẽ bị loại bỏ khỏi phương trình. Kết quả thu được các phương trình dưới đây:
Phương trình với biến đầu vào mang giá trị mã hóa
Y1 = 0,1227 + 0,0261 × X1 + 0,0201 × X2 + 0,0232 × X3– 0,0265 × X12 – 0,0348 × X22 Y2 = 0,6562 + 0,1126 × X1 + 0,0880 × X2 + 0,0982 × X3 + 0,0454 × X1X3 – 0,1356 × X12 – 0,0882 × X22 – 0,0282 × X32
Phương trình với biến đầu vào mang giá trị thực
Y1 = -0,516215 + 0,012318 × X1 + 0,015003 × X2 + 0,010604 × X3 – 0,000118 × X12 – 0,000348 × X22
Y2 = -1,76136 + 0,049601 × X1 + 0,045620 × X2 +0,039202 × X3 +0,000605 × X1X3 –
0,000603 × X12 – 0,000882 × X22 - 0,001128 × X32
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin vào các yếu tố của quá trình chiết xuất đựợc trình bày ở hình 3.4. Trong đó:
Đồ thị A1, A2, A3 biểu thị sự phụ thuộc của hàm lượng apigenin trong dịch chiết lần lượt với sự tương tác của: thời gian- nồng độ dung môi, thời gian- tỷ lệ dung môi/ dược liệu, nồng độ dung môi - tỷ lệ dung môi/ dược liệu.
Đồ thị B1, B2, B3 biểu thị sự phụ thuộc của hàm lượng luteolin trong dịch chiết lần lượt với sự tương tác của: thời gian- nồng độ dung môi, thời gian- tỷ lệ dung môi/ dược liệu, nồng độ dung môi - tỷ lệ dung môi/ dược liệu.
26 A1 B1 A2 B2 A3 B3
Hình 3.4. Đồ thị biểu thị sự phụ thuộc của hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin vào
27
3.2.3. Kết quả đánh giá mơ hình
Tiến hành đánh giá mơ hình bằng cách sử dụng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) thu được kết quả ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả phân tích ANOVA của mơ hình xây dựng được Y1: Hàm lượng apigenin trong dịch chiết (mg/g)
Biến số Tổng bình
phương Bậc tự do Phương sai F p
Mơ hình 0,0227 9 0,0025 127,17 <0,0001 X1- thời gian 0,0054 1 0,0054 273,87 <0,0001 X2- nồng độ dung môi 0,0032 1 0,0032 163,30 <0,0001 X3- tỷ lệ dung môi/ dược liệu 0,0043 1 0,0043 217,68 <0,0001 X1X2 1,6×109 1 1,6×109 0,0807 0,7836 X1X3 6,4×107 1 6,4×107 0,0323 0,8619 X2X3 0,0000 1 0,0000 1,59 0,2425 X12 0,0031 1 0,0031 154,62 <0,0001 X22 0,0053 1 0,0053 266,60 <0,0001 X32 0,0001 1 0,0001 4,61 0,0641 Phần dư 0,0002 8 0,0000 Sự không phù hợp (lack of fit) 0,0001 3 0,0000 0,9581 0,4803 Sai số thuần 0,0001 5 0,0000
Y2: Hàm lượng luteolin trong dịch chiết (mg/g)
Biến số Tổng bình
phương Bậc tự do Phương sai F p
Mơ hình 0,3849 9 0,0428 576,45 <0,0001
28 X2- nồng độ dung môi 0,0620 1 0,0620 835,36 <0,0001 X3- tỷ lệ dung môi/ dược liệu 0,0771 1 0,0771 1039,39 <0,0001 X1X2 9,025×107 1 9,025×107 0,0122 0,9149 X1X3 0,0082 1 0,0082 110,88 <0,0001 X2X3 0,0001 1 0,0001 0,9420 0,3602 X12 0,0803 1 0,0803 1081,88 <0,0001 X22 0,0340 1 0,0340 457,72 <0,0001 X32 0,0035 1 0,0035 46,74 0,0001 Phần dư 0,0006 8 0,0001 Sự không phù hợp (lack of fit) 0,0003 3 0,0001 1,83 0,2595 Sai số thuần 0,0003 5 0,0001 Nhận xét:
Từ bảng kết quả phân tích ANOVA cho thấy giá trị p ở cả hai mơ hình đều nhỏ hơn 0,0001. Điều đó có nghĩa là mơ hình xây dựng có ý nghĩa thống kê. Do đó, mơ hình này có thể sử dụng để dự đốn hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong dịch chiết tử quả cần tây dựa vào điều kiện chiết xuất.
Cả hai mơ hình đều cho thấy các biến độc lập: thời gian chiết (X1), nồng độ β-CD trong dung môi (X2), tỷ lệ dung mơi/ dược liệu (X3) đều có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng apigenin (Y1) và hàm lượng luteolin (Y2) (p < 0,0001). Bên cạnh đó, các biến tương tác và biến bậc 2 cũng ảnh hưởng đến hàm lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết.
Hệ số lack of fit: Giá trị F ở cả 2 mơ hình đều lớn hơn 0,05 cho thấy sự thiếu phù hợp của hai mơ hình khơng đáng kể so với sai số thuần túy.
Kết quả một số thơng số đánh giá chất lượng mơ hình bao gồm R2, R2 hiệu chỉnh (R2adjusted), hệ số R2 dự đoán (R2predicted) được trình bày ở bảng 3.4.
29
Bảng 3.4. Kết quả một số thông số đánh giá chất lượng của mơ hình
Thơng số R2 R2adjusted R2predicted
Hàm lượng luteolin 0.9985 0.9967 0.9861
Hàm lượng apigenin 0.9931 0.9852 0.9531
Nhận xét:
Hệ số xác định R2 thể hiện mối tương quan của các biến độc lập với các biến phụ thuộc, R2 càng gần 1 chứng tỏ mối tương quan giữa 2 biến càng chặt chẽ, nói cách khác thì mơ hình đã xây dựng càng phù hợp với dữ liệu hồi quy. Nhìn vào bảng kết quả ta thấy, ở cả hai mơ hình đều có R2 lớn hơn 0,99. Như vậy khoảng 99 % thơng tin có thể giải thích được bằng mơ hình, chỉ 1 % được giải thích do sai số ngẫu nhiên. Giá trị R2 đều cao cho thấy cả hai mơ hình đều có độ tuyến tính cao.
Tuy nhiên, việc sử dụng hệ số R2 để đánh giá mơ hình có hai hạn chế: thứ nhất giá trị R2 tăng khi tăng thêm biến độc lập và thứ hai là không thể xác định được trường hợp quá khớp dữ liệu (overfitting). Để khắc phục điều này, có thể lựa chọn 2 thơng số bổ sung là R2
hiệu chỉnh và R2 dự đoán để đánh giá cho chất lượng của mơ hình một cách tồn diện.
Hệ số R2 hiệu chỉnh (R2adjusted) phản ảnh mức độ ảnh hưởng của biến độc lên biến phụ thuộc. Giá trị R2 hiệu chỉnh càng gần R2 và gần 1 thì mơ hình xây dựng được có chất lượng càng cao. Thơng thường một mơ hình với giá trị R2 hiệu chỉnh lớn hơn 0,50 % đã được đánh giá là mơ hình nghiên cứu tốt. Như vậy, R2 hiệu chỉnh lớn hơn 0,98 cho thấy mơ hình có chất lượng. Độ chênh lệch giữa R2 và R2 hiệu chỉnh chỉnh nhỏ hơn 0,1 cũng thể hiện mức độ phù hợp cao của mơ hình.
Hệ số R2 dự đoán (R2predicted) xác định mức độ tốt của mơ hình hồi quy được đưa ra dự đốn. Độ chênh lệch giữa R2 hiệu chỉnh và R2 dự đoán nhỏ hơn 0,1 thể hiện khả năng dự đoán cao của mơ hình.
3.2.4. Lựa chọn điều kiện tối ưu cho các biến đầu vào
Với mục tiêu tối ưu thu được hàm lượng apigenin và luteolin cao nhất, tiến hành tối ưu các biến đầu vào đã được lựa chọn bằng phần mềm Design expert 13. Kết quả tối ưu hóa được trình bày ở hình 3.5 với hàm kì vọng thu được là 1,00.
30
Hình 3.5. Kết quả tối ưu điều kiện chiết xuất
Điều kiện chiết xuất tối ưu được xác định như sau: - Thời gian chiết xuất: 56,9359 phút
- Nồng độ β-CD trong dung môi: 24,809 mg/ml - Tỷ lệ dung môi/ dược liệu: 24,347 ml/g
Tại điều kiện tối ưu trên, mơ hình dự đốn kết quả hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong dịch chiết quả cần tây lần lượt là 0,146 mg/g và 0,776 mg/g.
3.2.5. Kết quả thẩm định mơ hình
Để phù hợp với việc thực nghiệm, lựa chọn điều kiện chiết xuất như sau: - Thời gian chiết xuất: 57 phút
- Nồng độ β-CD trong dung môi: 25 mg/ml - Tỷ lệ dung môi/ dược liệu: 25 ml/g
Tiến hành chiết xuất quả cần tây với các điều kiện trên (lặp lại 3 lần), kết quả được trình bày ở bảng 3.5.
31
Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra khả năng dự đốn của mơ hình ở điều kiện tối ưu
Thông số Giá trị dự đốn theo mơ hình Giá trị thực nghiệm (n=3) Độ chính xác Hàm lượng apigenin 0,146 0,147 ± 0,004 99,32 % Hàm lượng luteolin 0,776 0,781 ± 0,008 99,36 % Nhận xét:
Giá trị độ lệch chuẩn RSD của hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong dịch chiết nhỏ hơn 5%. Khơng những thế, độ chính xác giữa giá trị dự đốn với thực nghiệm của hàm lượng apigenin và luteolin lần lượt là 99,32 % và 99,36 % với sự sai lệch chỉ nhỏ hơn 1%. Do đó, mơ hình xây dựng có chất lượng và tính ổn định cao.
3.3. Kết quả so sánh khả năng chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây của β-CD với các dung môi thông thường với các dung môi thông thường
Tiến hành chiết xuất ở điều kiện tối ưu với các loại dung môi khác nhau (nước, ethanol 70%, methanol, β-CD) thu được hàm lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết từ quả cần tây được trình bày ở biểu đồ hình 3.6.
Hình 3.6. Kết quả so sánh hàm lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây
chiết xuất với các dung mơi khác nhau
Nhận xét:
Từ hình 3.6, hàm lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết tăng dần theo thứ tự: dịch chiết nước < dịch chiết ethanol 70% < dịch chiết methanol < dịch chiết β-CD. Dịch
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
Nước Ethanol 70% Methanol β-CD
Hàm lư ợn g (mg/ g)
32
chiết β-CD cho hàm lượng apigenin gấp 3 lần dịch chiết nước và gấp 2 lần dịch chiết ethanol 70% và methanol và cho hàm lượng luteolin gấp 2 lần dịch chiết nước và gấp 1,5 lần dịch chiết ethanol 70% và methanol. Từ đó cho thấy, β-CD có khả năng chiết apigenin và luteolin vượt trội hơn so với chiết bằng methanol, ethanol 70% và nước.
Hiện tượng này có thể được giải thích như sau: Do apigenin và luteolin đều có cấu trúc flavon và tồn tại ở dạng genin của nên tan tốt trong ethanol và methanol nhưng lại kém tan trong nước. Trong khi đó, β-CD có khả năng tạo phức với nhiều loại phân tử khác nhau giúp làm tăng độ tan trong nước của chúng. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng kích thước phân tử apigenin và luteolin phù hợp với lỗ trống của phân tử β-CD được quan sát thấy dựa vào các phương pháp phân tích nhiễu xạ tia X (XRD), nhiệt lượng quét vi sai (DSC), quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR), kính hiển vi điện tử quét (SEM) [12], [74]. Nhờ khả năng tạo phức này, giúp khả năng hòa tan apigenin và luteolin cao hơn đáng kể so với các dung mơi khác. Bên cạnh đó, flavonoid trong quả cần tây chủ yếu là các glycosid của apigenin và luteolin, song β-CD có thể có khả năng làm thủy phân các glycosid này thành các genin của chúng làm tăng hiệu quả chiết xuất vượt trội hơn mong đợi.
3.4. Bàn luận
3.4.1. Về việc sử dụng dung môi chiết xuất
Trong các thập kỷ trước, các dung môi hữu cơ như methanol, hexan, chloroform, ethyl acetat… được sử dụng phổ biến trong quá trình chiết xuất đem lại hiệu suất chiết cao hơn dung môi nước. Tuy nhiên, chúng thường dễ bay hơi ở nhiệt độ phòng, dễ cháy nổ, gây ô nhiễm môi trường, giá thành đắt [71]. Đặc biệt, việc tiếp xúc với dung môi hữu cơ trong thời gian dài có thể gây nhiễm độc thần kinh, ung thư, vơ sinh, mù lịa, gây độc cho gan, thận, suy hơ hấp… cho người lao động. Vì vậy, việc cải tiến dung mơi trong q trình chiết xuất là điều cần thiết.
Ngày nay, thế giới đang ngày càng tiến tới việc phát triển bền vững bằng cách ứng dụng hóa học xanh trong q trình phát triển các sản phẩm trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt trong lĩnh vực chiết xuất dược liệu, nhằm giảm thiểu sử dụng các hóa chất độc hại và ngăn ngừa ô nhiễm môi trường. Vào năm 1988, Paul T.Anastas và John C.Warner thuộc Cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (EPA) đã đề ra 12 nguyên tắc nền tảng trong phát triển hóa học xanh, trong đó nguyên tắc hướng tới sử dụng dung môi xanh nhằm thay thế các dung môi hữu cơ độc hại là một mục tiêu “xanh” quan trọng trong mọi lĩnh vực nói chung và trong lĩnh vực chiết xuất dược liệu nói riêng [51].
Những năm gần đây, hệ dung môi eutectic (DES) được sử dụng là dung môi chiết xuất xanh mới thay thế cho những dung môi hữu cơ thông thường được báo cáo trong một
33
số nghiên cứu, đặc biệt DES đã được báo cáo trong chiết xuất apigenin và luteolin trong quả cần tây [9]. Mặc dù chúng có nhiều ưu điểm hơn dung mơi hữu cơ về tính an tồn và bảo vệ mơi trường, song vẫn cịn tồn tại một số nhược điểm như có áp suất hơi thấp và độ nhớt cao nên thường gây khó khăn trong q trình phân lập và tinh chế. Khơng những vậy, độ nhớt cao cịn gây cản trở q trình dung mơi thấm vào dược liệu dẫn đến kéo dài thời gian chiết và xử lý tồn dư dung mơi sau này.
Bên cạnh đó, nhắc đến hóa học xanh, thì khơng thể khơng nhắc đến dung mơi nước. Nước không chỉ là dung môi dùng độc lập mà cịn là mơi trường hịa tan nhiều chất hóa học khác nhau. Trong chiết xuất, nước là dung môi được dùng phổ biến nhất, sẵn có, khơng độc, giá thành rẻ, ít tồn dư, khơng cháy, khơng gây ơ nhiễm mơi trường. Bên cạnh những ưu điểm, nước cịn tồn tại những nhược điểm như khả năng hịa tan khơng chọn lọc, hiệu suất chiết thấp, là môi trường thủy phân và phân hủy gây ra sự biến đổi của các hoạt chất, nhiệt độ sôi của nước cao nên thường gây khó khăn cho q trình tinh chế cao chiết. Khơng những vậy, nước cịn là môi trường thuận lợi cho các vi sinh vật phát triển nên thường gây khó khăn trong q trình bảo quản các dịch chiết. Vì vậy, khi sử dụng một chất an tồn hơn so với dung môi hữu cơ và hịa tan trong mơi trường nước tạo thành một dung môi xanh mới giúp khắc phục được những nhược điểm của dung môi truyền thống được đặt ra như một giả thuyết trong phát triển hóa học xanh.
Cyclodextrin là chất được cơng nhận an tồn (GRAS) theo Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ [68]. Nhờ cấu trúc đặc biệt, bên ngoài ưa nước, khoang bên trong kỵ nước giúp CD có khả năng hịa tan trong nước và được sử dụng như một dung môi chiết xuất xanh mới thay thế cho những dung môi thông thường đang được quan tâm trong một số nghiên cứu gần đây. Khơng những an tồn và thân thiện với mơi trường, CD cịn có khả năng tạo phức với nhiều loại phân tử khác nhau giúp làm tăng độ tan trong nước của các chất này, đem lại hiệu suất chiết cao. Đặc biệt, khả năng chiết xuất của CD cũng đã được chứng minh là cao hơn so với các dung môi truyền thống, cụ thể trong các nghiên cứu chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học như flavonoid, alcaloid, carotenoid [40], [48], [50]. Không chỉ làm tăng độ tan của hoạt chất, sự tạo phức cịn giúp cho các hoạt chất được bảo vệ, khơng bị tác động bởi các điều kiện vật lý và hóa học, làm cho hoạt chất có thể ổn định hơn trong môi trường dịch chiết. Không những vậy, phức hợp trong nước khơng cản trở q trình phân lập và tinh chế so với hệ dung môi eutectic, tạo điều kiện thuận lợi cho phát triển và bào chế các sản phẩm tự nhiên để phòng và điều trị bệnh trong tương lai.
Trong những năm gần đây, ứng dụng β-CD trong quá trình chiết xuất tối ưu những hợp chất có hoạt tính sinh học đã được báo cáo trong một số nghiên cứu. Tuy nhiên, khóa
34
luận này là nghiên cứu đầu tiên ứng dụng dung môi β-CD trong nước để chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây, là cơ sở cho việc phát triển các sản phẩm điều trị bệnh gút sau này. Bên cạnh những ưu điểm nổi bật như an tồn, thân thiện với mơi trường của dung môi, nghiên cứu cịn kết hợp với quy trình chiết đơn giản đem lại hiệu quả chiết xuất cao, từ đó