CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Cách tiếp cận
2.2.1.1. Kế thừa dữ liệu:
Thu thập, phân tích xử lý các số liệu về tình hình nhiễm giun trịn ký sinh ở một số loài cá thuộc bộ cá Vược, các dẫn liệu điều tra, nghiên cứu, thơng tin khoa học đã có từ trước tới nay có liên quan tới đối tượng nghiên cứu.
2.2.1.2. Điều tra thực địa:
Thực hiện các đợt điều tra thu mẫu tại thực địa, mẫu được phân tách, cố định và lưu lại mang về phân tích tại phịng thí nghiệm.
2.2.2. Thu thập cá biển (vật chủ) và định loại
2.2.2.1. Thu mẫu cá để mổ khám:
Thu thập mẫu cá bằng nhiều phương pháp (câu, chài lưới, mua khi còn sống ở các bè nuôi hoặc cảng cá, chợ đầu mối...); ghi tên các loài cá theo tên thơng thường, tách riêng từng lồi; giữ lạnh trong các thùng xốp bằng đá khô và tiến hành mổ khám mẫu cá tại hiện trường để thu mẫu giun tròn ký sinh. Theo dự kiến ban đầu sẽ điều tra nghiên cứu đối với 30-40 loài cá phổ biến và mổ khám 20-30 cá thể cá/loài ở mỗi vùng biển (miền Bắc, miền Trung, miền Nam). Nhưng do đặc tính phân bố của các lồi khác nhau và do tình hình nhiễm các lồi giun trịn phân bố ở các lồi cá khác nhau, nên nhóm nghiên cứu đã quyết định thực hiện phân tích mẫu
đối với cả 129 loài cá thu được, các mẫu cá được thu một cách ngẫu nhiên tại các cảng cá, chợ cá, đối với các lồi cá phổ biến thu ít nhất 10 cá thể/lồi/tỉnh.
2.2.2.2. Định loại vật chủ:
- Chụp ảnh vật chủ, đo kích thước các mẫu cá.
- Phân tích, định loại và so sánh, đối chiếu trong trang web www.fishbase.org [42]. - Các tài liệu sử dụng định loại cá:
+ Động vật chí Việt Nam tập 17, 19 [43-44]. + Danh mục cá biển Việt Nam tập III, IV [45-46].
- Tham khảo ý kiến chuyên gia: TS. Nguyễn Kiêm Sơn, nguyên cán bộ phịng Sinh thái Mơi trường nước, viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
2.2.3. Thu mẫu giun tròn (vật ký sinh) và định loại
2.2.3.1. Phương pháp thu giun tròn ký sinh
Sử dụng phương pháp mổ khám toàn diện Skrjabin, 1928[47]: Mổ khám từ miệng đến lỗ huyệt sau đó tách riêng các bộ phận, từng bộ phận sẽ được mổ và soi trực tiếp dưới kính lúp tìm giun trịn ký sinh. Sau khi kiểm tra dưới kính lúp, dùng phương pháp gạn lọc liên tục để tìm các mẫu giun trịn kích thước nhỏ cịn sót lại.
2.2.3.2. Định hình mẫu vật giun trịn
● Cố định mẫu giun tròn
- Mẫu giun trịn được giết chết bằng nước nóng 60 – 700c, sau đó các mẫu giun trịn được chia làm 2 phần, một phần lớn hơn được cố định trong dung dịch formalin 4% với mẫu giun nhỏ và formalin 10% với mẫu giun lớn, 1 phần nhỏ hơn được cố định trong cồn 70% để làm sinh học phân tử (khi cần), các mẫu được bảo quản trong các lọ nhựa kín có ren.
- Thay dung dịch formalin 4% và cồn 70% mới sau 5-7 ngày; mẫu giun tròn lớn thay 2 lần trong vòng 10-15 ngày.
2.2.3.3. Phương pháp định loại giun trịn bằng hình thái học
● Làm tiêu bản:
- Tiêu bản tạm thời (thực hiện với tất cả các mẫu giun tròn thu được cố định trong formalin): Làm trong giun tròn trong dung dịch hỗn hợp gồm glyxerine + axit lactic + nước cất theo tỷ lệ 1:1:1. Giun trịn có kích thước nhỏ thì chỉ làm trong bằng glyxerine, không dùng axit lactic.
-Tiêu bản cố định (phương pháp De Grisse, 1969)[48]: Mỗi lồi giun trịn làm từ 1- 2 tiêu bản với 1-4 giun tròn/tiêu bản.
+ Rút nước trong mẫu vật: 1. Mẫu giun trịn được thay dung dịch định hình bằng dung dịch I (gồm formalin 4% + glycerine/ tỷ lệ 99:1); để trong bình cồn ở tủ sấy với nhiệt độ 40ºC trong 24h; 2. Sau khi định hình bằng dung dịch I trong 24h, cho thêm vào khay mẫu 3 hoặc 4 giọt dung dịch II (gồm cồn 96% + glycerine theo tỷ lệ 95:5) cứ 2 tiếng thêm dung dịch một lần; 3. 24h tiếp theo sau khi cho dung dịch II thêm dung dịch III (gồm cồn 96% + glycerine theo tỷ lệ 50:50) vào khay mẫu, để trong tủ sấy 1 ngày.
+ Gắn tiêu bản cố định: Đặt mẫu vật lên lam kính với lượng glycerine vừa đủ và gắn bằng sáp ong.
Phương pháp chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét (SEM) (phương pháp Fagerholm, 1982)[49].
Các mẫu vật giun tròn sử dụng để chụp SEM được cố định ở trong dung dịch formol 4%, sau đó chuyển sang dung dịch tetra-oxit Osimi 1% trong khoảng 1h ở 400C; loại nước qua các dung dịch cồn 80%, 96%, 100% (2 lần); làm khô tới hạn trong CO2; được mạ vàng và quan sát, chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét FEIX L30 ESEMFEG.
Đối với các mẫu vật đã được bảo quản bằng cồn 70%, tiến hành loại nước trong các dung dịch cồn 95% và 100% khoảng 10-30 phút, làm khô tới hạn trong CO2 (Lee, 1992)[50]; được mạ vàng và quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét FEIX L30 ESEMFEG.
● Đo, vẽ, mơ tả hình thái mẫu vật:
- Đo, vẽ mẫu vật: Các mẫu vật giun trịn được đo, vẽ dưới kính hiển vi quang học Olympus CH40.
- Mơ tả hình thái mẫu vật: dựa trên các đặc điểm hình thái như: kích thước hình dạng cơ thể, miệng, thực quản, bộ phận sinh dục, …
● So sánh hình thái và định loại mẫu vật: Đối chiếu với các mơ tả bộ, họ, giống, lồi tương ứng trong các hệ thống phân loại giun tròn để định loại mẫu vật đến các bậc taxon phân loại có thể.
Các tài liệu sử dụng định loại giun tròn:
- Hệ thống giun sán học (Giun trịn ký sinh ở động vật có xương sống phần I, tập 3) (Yamaguti, 1961)[51].
- Khóa định loại giun trịn ký sinh ở động vật có xương sống (Anderson và cs., 2009)[52].
- Hệ thống phân loại và phát sinh loài (De Ley và cs., 2002) [53].
- Một hệ thống phân loại giun tròn mới: kết hợp giữa hình thái học với sinh học phân tử và sự chuyển đổi giữa các cấp bậc trong hệ thống phân loại (De Ley và Blexter, 2004)[9].
- Các lồi giun tóc ký sinh ở động vật máu lạnh (Moravec, 2001)[54]. - Giun sán ký sinh ở cá Ngừ châu Âu (Moravec, 2004)[55].
2.2.3.4. Phương pháp sinh học phân tử
Ở Việt Nam có một số tác giả đã ghi nhận loài Anisakis sp. (Hà Duy Ngọ và cs., 2009; Võ Thế Dũng, 2010) và trong nghiên cứu này chúng tôi cũng thu được lồi giun trịn thuộc giống Anisakis. Tuy nhiên, việc định loại bằng hình thái lồi
giun trịn này rất khó khăn, mặt khác hiện nay trên thế giới lồi Anisakis simplex là lồi có khả năng gây bệnh cho con người. Vì vậy, việc định loại xem lồi Anisakis sp. ở Việt Nam có phải là lồi Anisakis simplex hay khơng có ý nghĩa vô cùng quan trọng, nên chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật phân tử để giúp cho việc định loại lồi giun trịn này.
Mẫu giun tròn được tách chiết DNA tổng số bằng DNeasy Tisue Kit (QIAgen) theo quy trình của nhà sản xuất. Sử dụng 2 cặp mồi NC5-
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT (mồi xuôi) và NC2
TTAGTTTCTTCCTCCGCT (mồi ngược) trong phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS2-rDNA (Zhu và cs., 2000)[56].
Thành phần phản ứng PCR gồm: PCR Master Mix (2x) = 20 µl, Primer F (10 pmol) = 1 µl, Primer R (10 pmol) = 1 µl, DNA tổng số [10 ng] = 2 µl, H2O = 16 µl. Chu trình nhiệt bao gồm các giai đoạn: giai đoạn biến tính ban đầu 96oC biến tính trong 180 giây, tiếp theo là 35 chu trình nhiệt 95oC/30 giây, 48 - 51oC/40 giây, 72oC/45 giây, giai đoạn cuối kéo dài 72o
Các sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,0% và được nhuộm bằng dung dịch bắt màu ethidium bromide. Các sản phẩm PCR dương tính được gửi tới cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) để giải trình tự.
Trình tự của loài Anisakis sp. được Blast trên hệ thống NCBI
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) [57] đối chiếu so sánh trình tự với các trình tự có sẵn trên Genbank. Khoảng cách di truyền và đặc điểm di truyền được phân tích bằng chương trình Mega v.6 (Tamura và cs., 2013)[58] với mơ hình Kimura-2- Parameters (K2P) và khoảng 1000 bản sao. Cây phát sinh loài đã được xây dựng bằng phương pháp khả năng tối đa (ML) với mơ hình thay thế DNA tốt nhất trên Mega v.6.
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
2.2.4.1. Xác định cường độ nhiễm, tỷ lệ nhiễm giun sán ký sinh
- Cơng thức tính tỷ lệ nhiễm:
Tỷ lệ nhiễm (%) =
Số cá nhiễm giun tròn
Số cá mổ khám X 100
- Cường độ nhiễm (CĐN) giun tròn ký sinh: khoảng cách ít nhất và nhiều nhất (min-max) số cá thể giun trịn trên lồi vật chủ bị nhiễm lồi giun trịn đó.
+ CĐN thấp nhất (min): số lượng giun trịn ký sinh ít nhất trên 1 vật chủ. + CĐN cao nhất (max): số lượng giun tròn ký sinh nhiều nhất trên 1 vật chủ.
2.2.4.2. Xử lý số liệu:
Xử lý số liệu trên phần mềm Excel 2007
2.2.4.3. Xử lý ảnh, hình vẽ: