Phương pháp nghiên cứu cơ chế tác dụng

22 Phương pháp nghiên cứu

225 Phương pháp nghiên cứu cơ chế tác dụng

2 2 5 1 Phương pháp nghiên cứu mơ học (histochemical study)

Sau khi hồn thành thử nghiệm hành vi, chuột được truyền rửa tim mạch (cadiac perfusion) bằng nước muối sinh lý và sau đĩ bằng 4% paraformaldehyd (PFA) pha trong đệm muối phosphat (phosphate buffer saline - PBS) Não chuột sau đĩ được thu thập và được cố định bằng phương pháp thích hợp sau đĩ được đúc trong paraffin Não chuột sau đĩ được cắt thành các lát cắt kích thước 5 μm trên máy cắt paraffin và bảo quản ở 4oC đến khi sử dụng (Hình 2 11 )

Hình 2 11 (A) Dụng cụ cắt lát não; (B) Phần não đem đúc parafin (1) Phân tích sự thay đổi kích thước não thất bên

Các tiêu bản não ở ≈ -1,46 mm tính từ vùng bregma được nhuộm bằng tím cresyl và được dùng để tính tốn kích thước của não thất bên Vùng não thất bên được quan sát trên kính hiển vi Olympus PROVIS® (Olympus Inc , Tokyo, Nhật Bản) dưới độ phĩng đại vật thể × 1,25 Kích thước của vùng não thất bên được tính tốn bằng phần mềm Image J (phiên bản 1 41; NIH, MD, USA) [76]

Thơng số đánh giá: so sánh sự thay đổi tỷ lệ % giữa diện tích não thất bên trên tổng diện tích của lát cắt não

(2) Nhuộm hĩa mơ miễn dịch

Các tế bào thần kinh cholinergic trong vách giữa và các tế bào thần kinh mới sinh trong vùng hồi răng hồi hải mã được phân tích tương ứng bằng cách nhuộm hĩa mơ miễn dịch với chỉ dấu cholin acetyltransferase (ChAT, vị trí bregma≈ +0 98mm) và doublecortin (DCX, bregma ≈ −1 70mm) trên tiêu bản lát cắt não chuột Lát cắt não được loại bỏ paraffin bằng xylen và rehydrat hĩa bằng các dung dịch ethanol với các nồng độ giảm dần (100%, 95%, 75%, 50%) và cuối cùng là nước cất Sau khi ngâm rửa trong dung dịch đệm PBS, lát cắt não được ủ trong dung dịch hoạt hĩa kháng

nguyên (Target retrieval solution, Dako, Nhật Bản) ở nhiệt độ 95oC trong 30 phút Sau khi rửa lại với nước cất, lát cắt được ủ với dung dịch H2O2 0,1% trong 30 phút để loại bỏ peroxidase nội sinh trong tế bào, sau đĩ ủ lát cắt não với dung dịch 5% albumin huyết thanh bị (BSA) trong PBS, thời gian 1 giờ ở nhiệt độ phịng Ủ lát cắt trong kháng thể sơ cấp đa dịng anti-ChAT (AB-144P; Millipore, CA, USA, độ pha lỗng 1:200) hoặc anti-DCX (ab18723, Abcam, Cambridge, UK, độ pha lỗng 1:200) ở nhiệt độ phịng trong 1 giờ rồi để qua đêm ở 4oC Sau khi rửa với đệm PBS, lát cắt được ủ trong kháng thể thứ 2 tương ứng (anti-goat hoặc anti-rabbit) ở nhiệt độ phịng trong 1

giờ rồi nhuộm màu với dung dịch DAB (3,3'-diaminobenzidin), hematoxylin và lo ạ i nước để quan sát [164]

Tiêu bản não chuột được quan sát dưới kính hiển vi Olympus PROVIS® vật kính 10x và đếm số lượng tế bào dương tính (bắt màu nâu của DAB) với ChAT ở vách ngăn giữa và DCX (trên vùng cận tế bào hạt của vùng hồi răng)

Thơng số đánh giá:

- Số lượng tế bào dương tính với ChAT trong 1 lát cắt của mỗi não chuột (trung bình của 2-3 lát cắt/não) ở vị trí bregma ≈ +0 98 mm

- Số lượng tế bào dương tính với DCX trong 1 lát cắt của mỗi não chuột (trung bình của 2-3 lát cắt/não) ở vị trí bregma ≈ −1 70 mm

2 2 5 2 Phương pháp nghiên cứu hĩa thần kinh (neurochemical study)

Sau khi kết thúc thử nghiệm hành vi, dùng pentobarbital gây mê và giết chuột, tách vùng vỏ não và hồi hải mã đặt ngay vào trong nitơ lỏng để bảo quản tạm thời, sau đĩ cất trong tủ âm 80oC để bảo quản lâu dài cho đến khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo (Hình 2 12 )

(1) Kỹ thuật Real-time PCR (Polymerase chain reaction)

Mức độ biểu hiện gen của yếu tố tăng trưởng nội mơ mạch máu (VEGF) và thụ thể VEGF 2 (VEGFR2) trong hồi hải mã của chuột được phân tích bằng kỹ thuật nhân bản DNA (deoxyribonucleic acid) dựa vào các chu kỳ nhiệt (qRT-PCR) với trình tự đích là mRNA (message ribonucleic acid, RNA thơng tin), được tiến hành theo phương pháp đã cơng bố trước đây [76]

Chiết tách mRNA tổng số và tổng hợp cDNA (complementary DNA, DNA bổ sung)

mRNA tổng số được tách từ hồi hải mã chuột sử dụng Sepazol (Nacalai Tesque, Nhật Bản) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sau khi kiểm tra nồng độ và độ tinh khiết trên máy Nanodrop (Thermo Scientific, Mỹ), mRNA tổng số được hịa lỗng về nồng độ 0,33 μg/ml và bảo quản ở 20oC trước khi sử dụng để tổng hợp cDNA (chuỗi mạch đơn DNA được tổng hợp từ phân tử mRNA)

Quá trình tổng hợp cDNA từ khuơn mRNA tổng số sử dụng enzym phiên mã ngược (enzyme reverse transcriptase, M-MLV) và mồi oligo dT, được tiến hành trên máy PCR (Eppendorf, Mỹ) Hỗn hợp mỗi phản ứng PCR gồm: 3 μl mẫu mRNA (0,33 μg/ml), 1μl mồi oligo dT, 0,8 μl M-MLV, 0,2μl RNase inhibitor (chất ức chế

ribonuclease), 4 μl dNTP (4 nucleotid cơ bản gồm dATP, dCTP, dGTP và dTTP - 2,5 mM), 4 μl SF buffer (5x) và 5 μl nước DEPC (nước bất hoạt nuclease) Chu trình nhiệt của máy PCR được thiết lập như sau: 25oC trong 10 phút, 37oC trong 60 phút, 98oC trong 5 phút rồi duy trì ở 4oC Sản phẩm cDNA được bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng cho phản ứng realtime PCR

Phản ứng Real-time PCR

Phản ứng Real-time PCR được tiến hành sử dụng Fast SYBR Green Master Mix và hệ thống StepOne Real-time PCR System® (Applied BioSystem, USA) β- actin được sử dụng làm đối chứng nội chuẩn Trình tự các cặp mồi cho VEGF, VEGFR2 và β-actin được trình bày trong Bảng 2 3 Hỗn hợp phản ứng PCR của mỗi gen đích bao gồm: 2 μl cDNA, 0,4 μl mồi xuơi (10 μM), 0,4μl mồi ngược (10 μM), 10 µl Fast SYBR Green Master Mix và 7,2 µl DEPC Chu trình nhiệt của máy PCR được thiết lập như sau: 40 chu kỳ với chu trình nhiệt 95oC trong 5 giây, 58oC trong 30 giây, 72oC trong 10 giây và kết thúc ở 4oC Phân tích đường cong tín hiệu khuếch đại của mỗi gen được thực hiện sau mỗi chu kỳ nhiệt Đường chuẩn của các gen (hệ số tương quan R2 > 0,99) được tạo ra bằng cách vẽ biểu đồ nồng độ log của mỗi gen so với chu

kỳ ngưỡng (Ct)

Bảng 2 3 Cặp mồi cho các gen mục tiêu trong Real-time PCR

Thơng số đánh giá: Tỷ lệ biểu hiện gen VEGF/β-actin và tỷ lệ biểu hiện gen VEGFR2/β-actin

(2) Kỹ thuật Western blot

Biểu hiện protein VEGF và ChAT trong hồi hải mã chuột được đánh giá sử dụng kỹ thuật western blot theo phương pháp đã được mơ tả trong cơng bố trước đây của Xoan Le và cộng sự [76] Vùng hồi hải mã chuột được nghiền đồng thể trong đệm ly giải protein Protein tổng số (20 µg) của mỗi mẫu được tách trên gel SDS-PAGE 12% và chuyển sang màng PVDF (Bio-rad, CA, Hoa Kỳ) Các màng được khĩa trong sữa gầy 5% (skim milk) trong 1 giờ ở nhiệt độ thường và sau đĩ ủ bằng kháng thể đa dịng rabbit VEGF (A-20: sc-152, độ pha lỗng 1: 1000, Santa Cruz) hoặc kháng thể đa dịng goat ChAT (AB144P, độ pha lỗng 1: 3000, Millipore) và kháng thể đa dịng rabbit β-actin (PA1-183, độ pha lỗng 1: 2000, Thermo scientific) ở 4˚C qua đêm Màng được rửa 3 lần trong dung dịch TBS-T (Tris buffer saline-Tween) 0,1% và sau đĩ được ủ với kháng thể thứ cấp anti-rabbit hoặc anti-goat tương ứng, được liên kết với horseradish peroxidase (Cell Signalling) trong 1 giờ ở nhiệt độ phịng Băng được phát hiện bằng cách sử dụng Amersham ™ ECL ™ Prime (GE Healthcare,

Buckinghamshire, UK) Phức hợp phản ứng miễn dịch được phát hiện bằng phương pháp chemiluminescence Các băng phản ứng miễn dịch được phân tích sử dụng phần mềm Image J ver 1 41 (NIH)

Thơng số đánh giá: Tỷ lệ biểu hiện protein VEGF/ β-actin và tỷ lệ biểu hiện protein ChAT/β-actin

Gen Vị trí Trình tự mồi

VEGF mồi xuơi 5'- AGGAGAGATGAGCTTCCTACAG-3'

mồi ngược 5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCACAT-3'

VEGFR2 mồi xuơi 5'-GGGATGGTCCTTGACTACAG-3'

mồi ngược 5'-ACTGGTAGCCACTGGTCTGG-3'

β-actin mồi xuơi 5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’

(3) Xác định hoạt độ enzym acetylcholinesterase (AChE) trong vỏ não chuột ex

vivo và in vitro

Hoạt độ của acetylcholinesterase (AChE) trong vỏ não chuột được xác định trên cơ sở phương pháp của Ellman và cộng sự, cĩ cải tiến [165], bằng cách sử dụng

acetylthiocholin iodid (ATCI, 30 mM; Nacalai Tesque, Kyoto, Nhật Bản) làm chất nền ATCI tạo phức với acid 5,5´-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB, 10 mM; Sigma, St Louis, MO, Hoa Kỳ), giáng hĩa DTNB thành acid 5-thio-2-nitro-benzoic (TNB) TNB cĩ màu hơi vàng tỷ lệ với hoạt độ AChE và cĩ thể đọc được trong máy quang phổ UV- VIS (HumaReader HS; Human Diagnostics, Wiesbaden, Đức) ở bước sĩng 405 nm

- Trên ex vivo

Nguồn enzym được chuẩn bị như sau: Vỏ não chuột được nghiền đồng thể trong 10 lần thể tích dung dịch đệm phosphat lạnh 4oC (0,1 M, pH 7,4) cĩ chứa 1% Triton-X-100 (Sigma, St Louis, MO, USA), sau đĩ ly tâm ở 15 000 × g ở 4oC trong 20 phút Hút lấy dịch nổi của các mẫu não (là nguồn enzym), giữ ở nhiệt độ 4oC

Chuẩn bị trộn hỗn hợp vào đĩa 96 giếng: Thêm 50 μl dịch nổi hoặc dung dịch PBS chứa 1% Triton-X-100 vào từng giếng (lặp lại trên 2 giếng), dùng pipet 8 kênh để thêm cùng lúc 200 μl dung dịch hỗn hợp (master mix, gồm 20 μl DTNB 10 mM, 20 μl ATCI 30 mM, 160 μl PBS) vào mỗi giếng và trộn đều Tốc độ thủy phân AChE được đo kinetic (lắc ở tốc độ cao và đo sau mỗi khoảng thời gian 15 giây) ở bước sĩng 405 nm bằng máy Humareader HS trong vịng 3 phút ngay sau khi bổ sung cơ chất, được ước tính bằng sự hình thành dianion thiolat của DTNB ở 25oC [69]

Hoạt độ AChE được biểu thị dưới dạng nmol AChE thủy phân/mg mơ/phút Mỗi mẫu não chuột được tiến hành lặp lại 3 lần

Thơng số đánh giá: Hoạt độ AChE được tính bằng cơng thức sau:

Hoạt độ AChE (mOD / phút) = (Asample - Ablank) x (8/13,6) x 1,5 x 32/100

- Trên in vitro

Nguồn enzym: Vỏ não của chuột đực chủng Swiss albino được cân và đồng nhất trong 10 lần thể tích dung dịch đệm phosphat 0,1M (pH 7,4) chứa 1% Triton-X- 100 (Sigma, St Louis, MO, USA) Sau khi ly tâm ở 15 000 × g trong 20 phút, phần dịch nổi được thu thập và dùng làm nguồn enzym AChE Tất cả các bước được thực hiện ở 4oC

đĩa phẳng 96 giếng, thêm tiếp 25μl dung dịch enzym gốc pha lỗng 2 lần bằng pipet 8 kênh Sau đĩ ủ 20 phút ở 25oC Phản ứng được bắt đầu bằng cách thêm 200μl hỗn hợp (bao gồm ATCI, DTNB, PBS)

Phần trăm ức chế hoạt động AChE (I%) được tính bằng cơng thức sau: I% = 100 x (Ac - As)/(Ac - Ab)

Trong đĩ Ab, As và Ac lần lượt là độ hấp thụ của mẫu trắng (dung mơi khơng cĩ enzym), mẫu thử và mẫu chứng (dung mơi cĩ enzym)

Thơng số đánh giá: Nồng độ ức chế 50% (IC50): thu được từ đường cong

Prism (Graph Pad 5 0, ức chế phụ thuộc liều) [69]

2 2 5 3 Phương pháp sử dụng các chất đối kháng

Để tìm hiểu xem cơ chế chống trầm cảm của cao chiết phân đoạn hương nhu tía tác dụng rõ nhất cĩ liên quan đến hệ noradrenergic và dopaminergic hay khơng, vào tuần thứ 9 gây mơ hình UCMS, chuột được tiêm phúc mạc α-methyl-ρ-tyrosin (AMPT, 100 mg/kg), 1 liều duy nhất 4 giờ trước khi uống mẫu thử Sau 60 phút, thử nghiệm treo đuơi được thực hiện [166]

Để tìm hiểu cơ chế chống trầm cảm của cao chiết phân đoạn hương nhu tía tác dụng rõ nhất cĩ liên quan đến hệ serotonergic hay khơng, vào tuần thứ 11 gây mơ hình UCMS, chuột được tiêm phúc mạc DL-ρ-chlorophenyl alanin (PCPA, 80 mg/kg/ngày, 4 ngày liên tiếp trước thử nghiệm treo đuơi - TST) Trong ngày thử nghiệm, sau tiêm PCPA 30 phút, chuột uống mẫu thử và sau 60 phút tiến hành TST [166]