Nhận định kết quả: Kết quả máy đọc cho ra trên giá trị mẫu đƣợc coi là phản ứng với
HIV-RNA hoặc HBV-DNA hoặc HCV-RNA hoặc có thể nhiễm 2 trong 3 vi rút hoặc nhiễm cả 3 vi rút. Mẫu sẽ đƣợc xét nghiệm đơn để tìm ra mẫu nào có phản ứng. Mẫu phản ứng đƣợc lấy từ túi máu xét nghiệm kiểm tra lại. Nếu mẫu này có phản ứng đƣợc tiếp tục xét nghiệm phân biệt: với HBV-DNA, HCV-RNA hay HIV-RNA.
2.3.2.2. Kỹ thuật NAT Realtime PCR (theo quy trình kỹ thuật của hãng Roche)
Nguyên tắc: NAT Realtime PCR là một phƣơng pháp khuếch đại acid nucleic phát
hiện trực tiếp HIV-RNA, HBV- DNA, HCV- RNA.
Quy trình thực hiện nhƣ sau:
Tách chiết axit nucleic sử dụng COBAS® AmpliPrep Instrument
Axit nucleic từ các trình tự đích và thêm phân tử Armored RNA chứng nội(IC) đƣợc xử lý đồng thời. Các TaqScreen MPX Test trên COBAS®AmpliPrep Instrument thực hiện tuần tự theo 4 bƣớc:
Bƣớc 1: Ly giải và ổn định mẫu. Dung dịch proteinase phân hủy protein. Dung dịch ly giải phá vỡ cấu trúc vi rút, bất hoạt nucleases giải phóng RNA và DNA từ các hạt vi rút.
Trần Vân Chi 46 Luận văn Thạc sÜ Khoa häc
Bƣớc 2: Bắt giữ nucleic acid: RNA và DNA giải phóng đƣợc bám vào bề mặt silica của hạt Magetic Glass Particles trong môi trƣờng giàu muối và ái lực cao ở 370C. Các axit nucleic đƣợc giải phóng liên kết với các bề mặt silica bằng việc thêm hạt Magnetic Glass. Các điện tích dƣơng trên bề mặt hạt thủy tinh gắn điện tích âm của các axit nucleic dƣới nồng độ muối chaotropic và cƣờng độ ion của phản ứng ly giải.
Bƣớc 3: Tinh sạch: Nƣớc rửa loại bỏ các chất không liên kết và các tạp chất nhƣ protein biến tính, mảnh vỡ tế bào và các chất có khả năng ức chế PCR (nhƣ hemoglobin, vv), và giảm nồng độ muối. Việc xoay của bánh xe từ giúp cho quá trình rửa bằng cách làm cho MGP di chuyển lên xuống.
Bƣớc 4: Hịa trộn và giải phóng axit nucleic: Cho Elution Buffer vào ủ nhiệt độ 800C axit nucleic tinh khiết đƣợc giải phóng từ hạt Glass từ tính.
Khuếch đại tự động axit nucleic sử dụng COBAS® TaqMan® Analyzer
Sau khi axit nucleic của vi rút đƣợc tách chiết, Cobas® TaqScreen MPX Master Mix (MPX2 MMX) khuếch đại và phát hiện HIV-1 (Nhóm M, Nhóm O), HIV-2 và HCV RNA, DNA HBV và IC RNA. Mangan acetate kích hoạt, Cobas® TaqScreen MPX Master Mix cho phép phiên mã ngƣợc (RNA đích), khuếch đại PCR vùng bảo tồn cao của HIV-1 (nhóm M, nhóm O), HIV-2 và HCV RNA, DNA HBV sử dụng mồi đặc hiệu IC RNA . Phát hiện các axit nucleic khuếch đại đƣợc thực hiện bởi các tín hiệu huỳnh quang từ 5'- nucleolytic suy biến/ thối hóa của HIV-1 (nhóm M và O), HIV-2, HCV, HBV và IC dò. Bốn thuốc nhuộm huỳnh quang đƣợc sử dụng: một loại thuốc nhuộm đánh dấu IC, và ba loại thuốc nhuộm khác gắn mồi HIV, HCV và HBV, cho phép xác định độc lập của HIV, HCV và HBV đích, và IC.
Phiên mã ngƣợc và khuếch đại PCR
Phiên mã ngƣợc và khuếch đại PCR đƣợc thực hiện với một enzyme tái tổ hợp chịu nhiệt, Z05D DNA Polymerase. Sự có mặt của Mangan (Mn2 +), Z05D DNA
Trần Vân Chi 47 Luận văn Thạc sÜ Khoa häc
Polymerase dịch mã ngƣợc và hoạt động nhƣ polymerase DNA. Chất này cho phép cả phiên mã ngƣợc và khuếch đại PCR cùng xảy ra trong một phản ứng.
Khuếch đại PCR đƣợc diễn ra với việc dùng Z05D DNA Polymerase kéo dài đoạn axit nucleic cần nhân lên khi ủ cùng với các trình tự mồi tƣơng thích để tạo ra DNA (bản sao). Quá trình này đƣợc lặp lại cho nhiều chu kỳ, với mỗi chu kỳ tăng gấp đôi số lƣợng sản phẩm DNA phiên mã. Phản ứng PCR chỉ khuếch đại đoạn gen tƣơng ứng với các mồi; tồn bộ gen của vi rút khơng đƣợc khuếch đại.
Khuếch đại có chọn lọc
Khuếch đại có chọn lọc các axit nucleic khuôn bằng TaqScreen MPX sử dụng các enzym AmpErase (uracil-N-glycosylase) và deoxyuridine triphosphat (dUTP). Các enzyme AmpErase nhận ra và xúc tác phá hủy sợi DNA có chứa deoxyuridine, nhƣng khơng phải DNA có chứa deoxythymidine hoặc RNA chứa ribouridine. Deoxyuridine khơng có mặt trong DNA tự nhiên, nhƣng luôn luôn hiện diện trong sản phẩm khuếch đại vì trong thuốc thử MPX2 Master Mix sử dụng các deoxyuridine triphosphate với thymidine triphosphate nhƣ một dNTP; do đó, chỉ sản phẩm khuếch đại chứa deoxyuridine. Các enzyme AmpErase phá hủy sản phẩm khuếch đại nhiễm trƣớc khi khuếch đại DNA khn. Ngồi ra, các enzyme AmpErase (uracil-N- glycosylase) phá hủy bất kỳ sản phẩm không đặc hiệu đƣợc tạo thành sau bƣớc đầu hoạt động của Master Mix bởi Manganese. Các enzym AmpErase (uracil –N- glycosylase), có trong thuốc thử MPX2 Master Mix, xúc tác sự phân cắt của DNA chứa deoxyuridine tại vị trí deoxyuridine dƣ thừa bằng cách mở các chuỗi deoxyribose tại vị trí C1. Khi làm nóng trong bƣớc ln nhiệt đầu tiên, nhiệt độ phá vỡ chuỗi DNA lai ở vị trí deoxyuridine, do đó các DNA khơng thể phiên mã. Các enzyme AmpErase (uracil-N-glycosylase) không hoạt động trong một thời gian dài sau khi tiếp xúc với nhiệt độ trên 55ºC và do đó sẽ khơng phá hủy sản phẩm khuếch đại hình thành sau phản ứng PCR.
Trần Vân Chi 48 Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phát hiện các sản phẩm PCR sử dụng Cobas TaqMan Analyzer.
Khi khuếch đại PCR, nhiệt độ cao liên tục ở chu kỳ biến tính để đoạn gen cần nhân và IC phân tách thành DNA sợi đơn. Đầu dò oligonucleotide phát hiện đặc hiệu lai với chuỗi DNA sợi đơn để tạo thành sản phẩm DNA khuếch đại. Lai và phát hiện xảy ra đồng thời.
Phát hiện sản phẩm PCR
Các TaqScreen MPX Test Master Mix chứa đầu dò phát hiện đặc hiệu HIV-1 (Group M, O), HIV-2, HCV, HBV hoặc IC axit nucleic. Mỗi đầu dò phát hiện đƣợc gắn chất đánh dấu với:
1. một loại thuốc nhuộm huỳnh quang khô mà hoạt động nhƣ một kênh đọc. 2. một loại thuốc nhuộm khơ khác có tác dụng nhƣ một tín hiệu dập tắt.
Một tín hiệu đặc hiệu gắn đến đầu dò đặc hiệu viral đƣợc đo bằng 1 bƣớc sóng xác định. Một tín hiệu thứ hai gắn với mồi IC đặc hiệu và đƣợc đo bằng bƣớc sóng khác. Một loại tín hiệu dập tắt đơn đƣợc sử dụng trong tất cả các đầu dò. Hệ thống này cho phép phát hiện đồng thời và phân biệt với cả các trình tự đích vi rút ở bƣớc sóng, và IC ở một bƣớc sóng khác.
Trƣớc khi bắt đầu khuếch đại PCR, các đầu dị khơng hoạt động và các kênh đọc huỳnh quang bị ức chế bởi tín hiệu dập tắt do kiểu truyền năng lƣợng Förster. Trong quá trình khuếch đại PCR, các mồi lai đặc hiệu với các sợi DNA đơn đƣợc phân cắt bởi hoạt động nuclease 5 'đến 3' của Z05D DNA Polymerase thực hiện đồng thời với quá trình khuếch đại. Một kênh đọc và tín hiệu dập tắt đƣợc chia ra bởi sự phân cách, hoạt động phát huỳnh quang của kính đọc khơng đƣợc che lại. Với mỗi chu kỳ PCR, tăng số lƣợng mồi và tín hiệu đánh dấu đƣợc tạo ra tăng lên đồng thời.
Phát hiện thời gian thực và xác định sản phẩm PCR đƣợc thực hiện bằng cách đo sự phát huỳnh quang của các thuốc nhuộm phát hiện các viral đích và IC độc lập.
Trần Vân Chi 49 Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Nhận định kết quả:
Giá trị chu kỳ ngƣỡng CT (cycle of threshold) thu đƣợc là giá trị của số chu kỳ mà sản phẩm PCR đạt đến một giá trị xác định ở dãy tuyến tính. Nhƣ vậy, các phản ứng sử dụng ADN khn có nồng độ càng cao thì giá trị CT càng thấp. Do đó, phƣơng pháp Real Time-PCR để đánh giá độ nhạy của phƣơng pháp phát hiện HIV, HBV và HCV dựa trên giá trị CT thu đƣợc.
Quản lý dữ liệu NAT tự động bằng phần mềm PDM
Phần mềm PDM Roche cho phép ngƣời sử dụng xem xét và báo cáo kết quả. Các phần mềm Roche PDM gán kết quả xét nghiệm cho tất cả các xét nghiệm nhƣ không phản ứng, phản ứng hoặc khơng hợp lệ. Ngồi lấy và kiểm tra kết quả PCR, phần mềm PDM Roche cho phép ngƣời sử dụng in kết quả, tìm kiếm kết quả, chấp nhận kết quả, và tùy chọn chuyển kết quả đến một mạng nội bộ (LIS)
2.3.3. Quản lý và xử lý số liệu
Trần Vân Chi 50 Luận văn Thạc sĩ Khoa häc
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM MIỄN DỊCH KHÁNG NGUYÊN- KHÁNG THỂ 3.1.1. Tỷ lệ HBsAg phản ứng ở đơn vị máu hiến năm 2015 khu vực phía Bắc. 3.1.1. Tỷ lệ HBsAg phản ứng ở đơn vị máu hiến năm 2015 khu vực phía Bắc.
Bảng 3.1: Tỷ lệ HBsAg phản ứng bằng xét nghiệm miễn dịch
Kỹ thuật Kết quả Abbott Architect HBsAg Qual II CMIA (n= 87.894) Roche Elecsys HBsAg II ECLIA (n=86.409) p OR (95%CI) Tỷ lệ HBsAg phản ứng (sau 2 lần xét nghiệm) S/CO≥0,9. (n=656) 0,75 (n=682) 0,79 0,08 (0,87-1,08) 0,94 Tỷ lệ HBsAg không phản ứng (lần đầu XN phản ứng, XN lặp lại không phản ứng) S/CO<0,9.
0,07 (n=65) 0,02 (n=17) 1,05x10-7 3,97 (1,05-3,13)
Kết quả HBsAg các mẫu xét nghiệm lần đầu phản ứng S/CO ≥ 0,9 xét nghiệm lặp lại cho kết quả không phản ứng S/CO < 0,9 (xem phụ lục đính kèm).
Tỷ lệ HBsAg phản ứng xét nghiệm trên 2 hệ thống CMIA và ECLIA khác nhau khơng ý nghĩa thống kê với p=0,08 >0,05 có tỷ số chênh với độ tin cậy 95% là 0,94 với cận dƣới 0,87 cận trên là 1,08.
Tỷ lệ HBsAg phản ứng sau lần đầu xét nghiệm, xét nghiệm lặp lại không phản ứng so với tỷ lệ HBsAg phản ứng (tỷ lệ phản ứng giả sau lần đầu xét nghiệm HBsAg) trên 2 hệ thống CMIA và ECLIA khác nhau có ý nghĩa thống kê với p= 1,05x10- 7<0,05. Tỷ lệ phản ứng giả trên hệ thống Abbott Architect HBsAg Qual II CMIA nhiều hơn trên hệ thống Roche Elecsys HBsAg II ECLIA là có ý nghĩa thống kê. Hai kỹ thuật xét nghiệm điện hóa phát quang và hóa phát quang là hệ thống xét nghiệm tự ng
Trần Vân Chi 51 Luận vn Thc sĩ Khoa học
hoàn toàn nên các yếu tố bên ngoài ảnh hƣởng đến độ nhạy kỹ thuật đƣợc giảm thiểu tối đa. So sánh nghiên cứu về tỷ lệ HBsAg phản ứng với:
Bảng 3.2: Tỷ lệ HBsAg ngƣời hiến máu trong nghiên cứu so với các tác giả
TT Tác giả Bệnh viện Năm Kỹ thuật XN Số đơn vị
máu hiến Tỷ lệ % HBsAg (+) 1 Phạm Tuấn Dƣơng và cộng sự VHHTMTW 2012- 2013 ELISA+CMIA 351685 0,94 2 Vũ Thùy An và cộng sự BV Chợ Rẫy 2012 ELISA+CMIA 13467 6,66 3 Đào Ngọc Tuyền và cộng sự BVHHTM HCM 2008- 2009 ELISA 214022 3,58 VHHTMTW 2015 CMIA+ECLIA 174303 0,77
Tỷ lệ HBsAg phản ứng của tác giả Vũ Thùy An (2012), Đào Ngọc Tuyền (2010) cao hơn tỷ lệ HBsAg phản ứng của chúng tơi có thể do ngƣời hiến máu phía Nam khơng đƣợc xét nghiệm sàng lọc nhanh HBsAg trƣớc khi lấy máu để loại bỏ ngƣời hiến máu có HBsAg nhanh dƣơng tính.
Tỷ lệ HBsAg phản ứng của tác giả Phạm Tuấn Dƣơng năm 2012-2013 cao hơn tỷ lệ HBsAg phản ứng của chúng tơi có thể do ảnh hƣởng của chƣơng trình tiêm chủng viêm gan B ngày một hiệu quả. Tỷ lệ HBsAg phản ứng của chúng tôi thấp hơn tỷ lệ HBsAg (+) năm 2012-2013 có thể do chúng tơi sử dụng sinh phẩm hóa phát quang CMIA và điện hóa phát quang ECLIA là hai kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, là hai kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch tự động hoàn tồn, khép kín nên giảm thiểu tỷ lệ phản ứng giả do ngoại nhiễm.
Sau khi xét nghiệm sàng lọc sinh phẩm nhanh ngƣời hiến máu trƣớc khi lấy đơn vị máu, tỷ lệ HBsAg phản ứng khi xét nghiệm bằng ELISA 2012 là 0,94% nhƣng khi xét nghiệm sàng lọc bằng sinh phẩm hóa phát quang tỷ lệ HBsAg phản ứng là 0,75% vì sinh phẩm Abbott Architect HBsAg Qualitative II có độ đặc hiệu cao. Độ nhạy ≤0.05 IU/ml, 99,52% (nghiên cứu phát hiện 418/420 mẫu chuyển đổi), độ đặc hiệu 99,87%
Trần Vân Chi 52 Luận văn Thạc sĩ Khoa häc
(nghiên cứu phát hiện 6001/6009 mẫu). Sinh phẩm đƣợc thiết kế để phát hiện HBV genotypes A ,F và H. Sinh phẩm nghiên cứu phát hiện đƣợc các dàn mẫu chuẩn HBV genotypes A, B, C, D và E, dàn mẫu chuẩn HBV genotypes F và dàn mẫu HBV genotypes H.
Tỷ lệ HBsAg phản ứng khi xét nghiệm sàng lọc bằng sinh phẩm Roche Elecsys HBsAg II ECLIA là 0,79% có thể do độ đặc hiệu sinh phẩm cao. Độ nhạy lâm sàng sinh phẩm Roche Elecsys HBsAg II ECLIA là 99,9% (1025 mẫu và trên 56 dàn mẫu chuyển đổi huyết thanh với các kiểu subtype A, B, C, C/E, D, E, F, G, và các thể đột biến khác nhau). Độ đặc hiệu là 99,91% (6360 ngƣời hiến máu), độ đặc hiệu có phản ứng lặp lại (RR) là 99,98%. Sinh phẩm sử dụng các kháng thể đơn dòng và đa dòng kháng HBs (chuột và cừu) để xác định HBsAg thể thông thƣờng và thể đột biến (do áp lực chọn lọc, vi rút có thể biểu hiện nhiều thể đột biến khác nhau ngoài kháng nguyên HBsAg a,d,y,w1-w4,r và q3).
3.1.2. Tỷ lệ anti HCV phản ứng ở đơn vị máu hiến 2015 khu vực phía Bắc Bảng 3.3: Tỷ lệ anti HCV phản ứng bằng xét nghiệm miễn dịch Bảng 3.3: Tỷ lệ anti HCV phản ứng bằng xét nghiệm miễn dịch
Kỹ thuật Tỷ lệ nhiễm Abbott Architect anti HCV CMIA (n=90.840)% Roche Elecsys anti HCV II ECLIA (n=88.524) % p OR (95%CI) Tỷ lệ anti HCV phản ứng (sau 2 lần xét nghiệm) S/CO≥0,9. (n=392) 0,43 (n=210) 0,24 1,1x10 -12 1,82 (1,09-1,83) Tỷ lệ anti HCV không phản ứng (lần
đầu XN phản ứng, XN lặp lại không phản ứng) S/CO<0,9. 0,005 (n=5) 0,007 (n=6) 0,17 0,44 (0,21-2,33)
Kết quả anti HCV các mẫu xét nghiệm lần đầu phản ứng S/CO ≥ 0,9 xét nghiệm lặp lại cho kết quả không phản ứng S/CO < 0,9 (xem phụ lục)
Trần Vân Chi 53 Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Tỷ lệ anti HCV phản ứng trên hai hệ thống CMIA và ECLIA khác nhau có ý nghĩa thống kê với p=1,1x10-12
<0,05 tỷ số chênh OR là 1,82 cận dƣới 1,09 cận trên 1,83.
Tỷ lệ phản ứng giả sau lần đầu xét nghiệm (tỷ lệ anti HCV phản ứng sau lần đầu xét nghiệm, không phản ứng xét nghiệm lặp lại) so với tỷ lệ anti HCV phản ứng khác nhau không ý nghĩa thống kê với p=0,17>0,05, tỷ số chênh OR độ tin cậy là 95% cận trên là 2,33 và cận dƣới là 0,21.
Bảng 3.4: Tỷ lệ anti HCV phản ứng ở ngƣời hiến máu so với các tác giả
TT Tác giả Bệnh viện Năm Kỹ thuật XN Số đơn vị máu hiến
Tỷ lệ % anti HCV(+) 1 Phạm Tuấn Dƣơng và cộng sự VHHTMTW 2012-2013 ELISA+CMIA 351685 0,38 2 Nguyễn Thị Thu Hiền và cộng sự BV HNVT Hải Phòng 2010- 2011 ELISA 40168 0,44 2 Vũ Thùy An và cộng sự BV Chợ Rẫy 2012 ELISA+CMIA 13467 0,87 3 Đào Ngọc Tuyền và cộng sự BVHHTM HCM 2008- 2009 ELISA 214022 0,60 VHHTMTW 2015 CMIA+ECLIA 179364 0,34
Tỷ lệ anti HCV phản ứng của tác giả Vũ Thùy An (2012), Đào Ngọc Tuyền (2010) cao hơn tỷ lệ anti HCV phản ứng của chúng tơi có thể do ngƣời hiến máu miền Nam có tỷ lệ nhiễm HCV cao hơn ngƣời hiến máu miền Bắc.
Tỷ lệ anti HCV phản ứng của tác giả Phạm Tuấn Dƣơng (2014) tƣơng đồng với tỷ lệ anti HCV phản ứng của chúng tơi có thể do tƣơng đồng về tỷ lệ nhiễm.
Tỷ lệ anti HCV phản ứng của tác giả Nguyễn Thị Thu Hiền (2012) cao hơn tỷ lệ anti HCV phản ứng của chúng tơi có thể do kỹ thuật ELISA bán tự động nên còn một tỷ lệ ngoại nhiễm, hoặc do kỹ thuật ngƣời làm xét nghiệm nên vẫn còn một số lƣợng đáng kể tỷ lệ phản ứng giả. Bên cạnh đó cũng khơng loại trừ kết quả không phản ứng
Trần Vân Chi 54 Luận văn Thạc sĩ Khoa häc
giả có thể do kỹ thuật làm xét nghiệm bán tự động, trang thiết bị máy móc xét nghiệm. Phịng xét nghiệm sàng lọc máu bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phịng có tham gia chƣơng trình ngoại kiểm xét nghiệm anti HCV năm 2011của Viện HHTMTW kết luận sai tình trạng mẫu anti HCV. Vì vậy tỷ lệ anti HCV phản ứng làm bằng kỹ thuật ELISA bán tự động có nhiều yếu tố ảnh hƣởng nên cao hơn tỷ lệ anti HCV phản ứng của chúng tơi xét nghiệm trên hệ thống kín tự động hồn tồn hóa phát quang CMIA và