Chúng tơi thiết kế mơ hình nghiên cứu theo hƣớng dẫn hoạt động truyền máu TT26/2013/TT-BYT. XN miễn dịch HBsAg, anti HCV, HIVAgAb Mẫu máu Loại (không XN NAT) Không phản ứng Không phản ứng Phản ứng Không phản ứng Không phản ứng XN lặp lại miễn dịch XN NAT ID MPX Phản ứng NAT XN NAT MP (Pool 4/6) XN lặp lại NAT Không phản ứng Phản ứng Phản ứng Phản ứng Phản ứng Không phản ứng XN Real time PCR HCV, HIV XN antiHBc
Trần Vân Chi 38 Luận văn Thạc sĩ Khoa học
2.3.1. Xét nghiệm miễn dịch HBV, HCV, HIV theo phƣơng pháp miễn dịch tự động
hóa phát quang CMIA và Miễn dịch tự động điện hóa phát quang ECLIA.
Các vi rút đƣợc phát hiện gián tiếp kháng thể/kháng nguyên dựa trên nguyên lý tƣơng tác miễn dịch kháng nguyên-kháng thể bằng kỹ thuật Hóa phát quang CMIA hoặc kỹ thuật Điện hóa phát quang ECLIA. Các mẫu máu đƣợc xét nghiệm cùng thời điểm trong ngày và đƣợc chia vào 2 hệ thống xét nghiệm tự động: 50% mẫu đƣợc chia vào hệ thống tự động Abbott Architect i2000 (CMIA), 50% mẫu đƣợc chia vào hệ thống tự động Roche Cobas e602.
2.3.1.1. Kỹ thuật Hóa phát quang CMIA (Chemiluminescent Microparticle Immunoassay)(theo quy trình kỹ thuật của hãng Abbott)
Nguyên tắc: dựa vào tƣơng tác miễn dịch kháng nguyên-kháng thể và gắn chất phát
quang là Acridium. Chất này sẽ đƣợc giải phóng ra nhờ dung dịch pretrigger và phản ứng với trigger tạo ra các photon ánh sáng. Năng lƣợng đƣợc đo bằng cƣờng độ ánh sáng.
Quy trình thực hiện nhƣ sau:
Mẫu máu đƣợc ly tâm 3500 vòng/phút trong 20 phút để tách huyết thanh và xét nghiệm trên máy Abbott Architect i2000. Máy xét nghiệm quét barcode chỉ định xét nghiệm HBsAg, anti HCV, HIV AgAb Combo cho mẫu. Máy chạy xét nghiệm hoàn toàn tự động cho đến khi ra kết quả xét nghiệm. Các bƣớc thực hiện trong máy xét nghiệm tự động:
Bƣớc 1: Phản ứng giữa vi hạt có gắn kháng thể/kháng nguyên và kháng nguyên/kháng thể có trong mẫu, ủ để phản ứng diễn ra hoàn toàn.
Bƣớc 2: Rửa bằng dung dịch rửa để loại bỏ các thành phần không phản ứng. Bƣớc 3: Cho cộng hợp có đánh dấu Acridinium, ủ để hình thành phức hợp. Bƣớc 4: Rửa để loại bỏ cộng hợp thừa.
Trần Vân Chi 39 Luận văn Thạc sĩ Khoa häc
Bƣớc 5: Cho Pre – trigger vào tạo môi trƣờng acid cũng nhƣ giải phóng Acridinium thành dạng tự do.
Bƣớc 6: Cho Trigger vào tạo phản ứng giải phóng photon, năng lƣợng đƣợc đo ngay lâp tức bằng CMIA optic dƣới dạng cƣờng độ ánh sáng.
Hình 2.2: Phản ứng hóa phát quang CMIA (hãng Abbott) Nhận định kết quả:
- Giá trị ngƣỡng của phản ứng Cut off (CO) bằng trung bình tính hiệu hóa phát quang (Relative Light Unit) Calibrator qua 3 lần chạy lặp lại.
- S/CO (sample/ cut off)= RLU mẫu/ RLU ngƣỡng. S/CO <0,9: không phản ứng, không cần xét nghiệm lại
S/CO ≥ 0,9: phản ứng, xét nghiệm lặp lại 2 lần. Kết quả xét nghiệm 2 lần lặp lại khơng có phản ứng, mẫu đƣợc coi là khơng có phản ứng . Kết quả xét nghiệm 2 lần lặp lại có một hay cả 2 kết quả S/CO≥ 0,9, mẫu đƣợc coi là phản ứng
Trần Vân Chi 40 Luận văn Th¹c sÜ Khoa häc
2.3.1.2. Kỹ thuật Điện hóa phát quang ECLIA (Electrochemiluminescence Immunoassay)(theo quy trình kỹ thuật của hãng Roche)
Nguyên tắc: dựa vào tƣơng tác miễn dịch kháng nguyên-kháng thể và gắn chất phát
quang là Ruthenium: Tris(2,2’-bipyridyl) ruthenium (II)- complex (Ru(bpy)32+
. Các vi hạt đối từ sẽ đƣợc bắt giữ trên bề mặt của điện cực. Cho điện áp vào điện cực sẽ tạo nên sự phát quang hóa học đƣợc đo bằng bộ khuyếch đại quang tử.
Quy trình thực hiện nhƣ sau:
Mẫu máu đƣợc ly tâm 3500 vòng/phút trong 20 phút để tách huyết thanh và xét nghiệm trên máy Roche Cobas e602. Máy xét nghiệm quét barcode chỉ định xét nghiệm cho mẫu. Máy chạy xét nghiệm hoàn toàn tự động cho đến khi ra kết quả xét nghiệm. Các bƣớc thực hiện trong máy xét nghiệm tự động:
Bƣớc 1: Mẫu ủ với chất ly giải vi rút.
Bƣớc 2: Mẫu đƣợc ủ với 2 kháng thể/kháng nguyên gắn biotin và kháng thể/ kháng nguyên gắn ruthenium. Một phức hợp sandwich đƣợc thành lập có gắn nhãn biotin và ruthenium.
Bƣớc 3: Sau đó các vi hạt từ tính phủ streptavidin đƣợc cho vào, các vi hạt sẽ gắn với các phức hợp đƣợc thành lập trƣớc đó thơng qua mối liên kết biotin-streptavidin.
Bƣớc 4: Hỗn hợp phản ứng đƣợc đƣa vào buồng đo, nơi các vi hạt đƣợc giữ lại trên bề mặt điện cực dƣới tác động của từ trƣờng. Sau đó các thành phần khơng gắn kết bị rửa trơi. Phản ứng phát quang diễn ra dƣới tác động kích thích của dịng điện và đƣợc đo bằng máy nhân quang.
Nhận định kết quả:
- Giá trị ngƣỡng của phản ứng Cut off (CO) bằng trung bình tín hiệu hóa phát quang (Relative Light Unit) Calibrator qua 3 lần chạy lặp lại.
Trần Vân Chi 41 Luận văn Thạc sĩ Khoa học
S/CO <0,9: không phản ứng, không cần xét nghiệm lại
S/CO ≥0,9: phản ứng, xét nghiệm lặp lại 2 lần. Kết quả xét nghiệm 2 lần lặp lại không có phản ứng, mẫu đƣợc coi là khơng có phản ứng . Kết quả xét nghiệm 2 lần lặp lại có một hay cả 2 kết quả phản ứng, mẫu đƣợc coi là phản ứng.
Anti HBsAg Vi hạt từ
–Ab- Biotin phủ streptavidin
ủ 9 phút ủ 9 phút ủ 9 phút
Mẫu Phát hiện
Anti HBsAg –Ab- Ruthenium
Hình 2.3: Phản ứng điện hóa phát quang ECLIA (hãng Roche)
2.3.2. Xét nghiệm sinh học phân tử NAT HBV, HCV, HIV (theo kỹ thuật TMA và
kỹ thuật Realtime PCR).
Các mẫu không phát hiện nhiễm vi rút bằng xét nghiệm miễn dịch đƣợc thực hiện xét nghiệm sinh học phân tử NAT. Hệ gen các vi rút đƣợc phát hiện trực tiếp dựa trên nguyên lý khuếch đại gen bằng kỹ thuật TMA hoặc kỹ thuật Realtime PCR. Các mẫu máu đƣợc xét nghiệm đƣợc chia vào 2 hệ thống xét nghiệm tự động : 50% mẫu đƣợc chia vào hệ thống tự động Procleix® Panther System , 50% mẫu đƣợc chia vào hệ thống tự động Roche s201.
2.3.2.1. Kỹ thuật NAT TMA (Transcription-Mediated Amplification)(theo quy trình kỹ thuật của hãng Grifols)
Nguyên tắc: NAT TMA là một phƣơng pháp khuếch đại acid nucleic phát hiện trực
Trần Vân Chi 42 Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Khuếch đại trình tự đích bởi TMA, Phát hiện trình tự khuếch đại bởi HPA. Bắt giữ trình tự đích sử dụng những hạt bi từ có gắn đi Poly-T sẽ bắt cặp với các oligonucleotide có đi Poly- A bắt giữ các trình tự đích mong muốn. Khuếch đại trình tự đích bởi TMA ở nhiệt độ 41.50C nhờ 2 enzym MMLV reverse transcriptase và T7 RNA Polymerase. MMLV reverse transcriptase (Moloney murine leukemia virus Reverse Transcriptase) là 1 enzym sao chép ngƣợc đƣợc sử dụng để tạo ra cDNA (trong đó bao gồm các trình tự đoạn khởi động của T7 RNA Polymerase) trình tự đích. T7 RNA Polymerase là 1 enzym đƣợc sử dụng để tạo nhiều bản sao của RNA amplicon từ cDNA. Phát hiện trình tự khuếch đại bởi HPA (Hybridization Protection Assay) sử dụng probe gắn hóa chất phát quang Acridinium Ester (AE) đƣợc bảo vệ khỏi môi trƣờng kiềm khi gắn với sản phẩm lai. Hóa chất phát quang AE trong probe không gắn đƣợc với sản phẩm lai sẽ bị phá hủy trong môi trƣờng kiềm. Probe gắn với sản phẩm lai sẽ đƣợc phát hiện bởi máy đo tín hiệu phát quang.
Quy trình thực hiện nhƣ sau:
Mẫu máu chống đông bằng EDTA K3 đƣợc ly tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút để tách huyết tƣơng, lựa chọn mẫu không phát hiện nhiễm vi rút bằng phƣơng pháp miễn dịch đƣợc đƣa vào máy xét nghiệm trên hệ thống Panther. Máy chạy xét nghiệm hoàn toàn tự động cho đến khi ra kết quả xét nghiệm. Các bƣớc thực hiện trong máy xét nghiệm tự động: (1Hill C. Gen-Probe Transcription-Mediated Amplification: System Principles. Available at: www.gen-probe.com. Accessed May 12, 2012)
Bƣớc 1: Bắt giữ trình tự đích: mẫu đƣợc xử lý với chất hoạt động bề mặt để hòa tan vỏ bọc của vi rút, bất hoạt các nuclease, giải phóng RNA, DNA của vi rút và tăng cƣờng sự ổn định của RNA, DNA vi rút. Sử dụng hóa chất bắt giữ trình tự đích (wTCR) để phân lập RNA, DNA của vi rút từ mẫu, trình tự đích sẽ bị bắt trên những vi hạt có từ tính và chúng bị tách ra khỏi huyết tƣơng trong môi trƣờng từ.
Trần Vân Chi 43 Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Hình 2.4: Ngun tắc bắt giữ trình tự đích (hãng Grifol)
Bƣớc 2: Khuếch đại trình tự đích bởi TMA: là một hệ thống khuếch đại acid nucleic
đích tự động, đẳng nhiệt có thể tạo ra hơn một tỷ bản copy RNA từ RNA hay DNA đích trong vịng 1 giờ. MMLV reverse transcriptase sao chép ngƣợc tạo ra cDNA (trong đó bao gồm các trình tự đoạn khởi động của T7 RNA Polymerase) trình tự đích. T7 RNA Polymerase tạo nhiều bản sao của RNA amplicon từ cDNA.
Trần Vân Chi 44 Luận văn Thạc sĩ Khoa học