CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2.Xét nghiệm sinh học phân tử NAT HBV, HCV, HIV
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2.Xét nghiệm sinh học phân tử NAT HBV, HCV, HIV
kỹ thuật Realtime PCR).
Các mẫu không phát hiện nhiễm vi rút bằng xét nghiệm miễn dịch đƣợc thực hiện xét nghiệm sinh học phân tử NAT. Hệ gen các vi rút đƣợc phát hiện trực tiếp dựa trên nguyên lý khuếch đại gen bằng kỹ thuật TMA hoặc kỹ thuật Realtime PCR. Các mẫu máu đƣợc xét nghiệm đƣợc chia vào 2 hệ thống xét nghiệm tự động : 50% mẫu đƣợc chia vào hệ thống tự động Procleix® Panther System , 50% mẫu đƣợc chia vào hệ thống tự động Roche s201.
2.3.2.1. Kỹ thuật NAT TMA (Transcription-Mediated Amplification)(theo quy trình kỹ thuật của hãng Grifols)
Nguyên tắc: NAT TMA là một phƣơng pháp khuếch đại acid nucleic phát hiện trực
Trần Vân Chi 42 Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Khuếch đại trình tự đích bởi TMA, Phát hiện trình tự khuếch đại bởi HPA. Bắt giữ trình tự đích sử dụng những hạt bi từ có gắn đi Poly-T sẽ bắt cặp với các oligonucleotide có đi Poly- A bắt giữ các trình tự đích mong muốn. Khuếch đại trình tự đích bởi TMA ở nhiệt độ 41.50C nhờ 2 enzym MMLV reverse transcriptase và T7 RNA Polymerase. MMLV reverse transcriptase (Moloney murine leukemia virus Reverse Transcriptase) là 1 enzym sao chép ngƣợc đƣợc sử dụng để tạo ra cDNA (trong đó bao gồm các trình tự đoạn khởi động của T7 RNA Polymerase) trình tự đích. T7 RNA Polymerase là 1 enzym đƣợc sử dụng để tạo nhiều bản sao của RNA amplicon từ cDNA. Phát hiện trình tự khuếch đại bởi HPA (Hybridization Protection Assay) sử dụng probe gắn hóa chất phát quang Acridinium Ester (AE) đƣợc bảo vệ khỏi môi trƣờng kiềm khi gắn với sản phẩm lai. Hóa chất phát quang AE trong probe không gắn đƣợc với sản phẩm lai sẽ bị phá hủy trong môi trƣờng kiềm. Probe gắn với sản phẩm lai sẽ đƣợc phát hiện bởi máy đo tín hiệu phát quang.
Quy trình thực hiện nhƣ sau:
Mẫu máu chống đông bằng EDTA K3 đƣợc ly tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút để tách huyết tƣơng, lựa chọn mẫu không phát hiện nhiễm vi rút bằng phƣơng pháp miễn dịch đƣợc đƣa vào máy xét nghiệm trên hệ thống Panther. Máy chạy xét nghiệm hoàn toàn tự động cho đến khi ra kết quả xét nghiệm. Các bƣớc thực hiện trong máy xét nghiệm tự động: (1Hill C. Gen-Probe Transcription-Mediated Amplification: System Principles. Available at: www.gen-probe.com. Accessed May 12, 2012)
Bƣớc 1: Bắt giữ trình tự đích: mẫu đƣợc xử lý với chất hoạt động bề mặt để hòa tan vỏ bọc của vi rút, bất hoạt các nuclease, giải phóng RNA, DNA của vi rút và tăng cƣờng sự ổn định của RNA, DNA vi rút. Sử dụng hóa chất bắt giữ trình tự đích (wTCR) để phân lập RNA, DNA của vi rút từ mẫu, trình tự đích sẽ bị bắt trên những vi hạt có từ tính và chúng bị tách ra khỏi huyết tƣơng trong môi trƣờng từ.
Trần Vân Chi 43 Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Hình 2.4: Ngun tắc bắt giữ trình tự đích (hãng Grifol)
Bƣớc 2: Khuếch đại trình tự đích bởi TMA: là một hệ thống khuếch đại acid nucleic
đích tự động, đẳng nhiệt có thể tạo ra hơn một tỷ bản copy RNA từ RNA hay DNA đích trong vịng 1 giờ. MMLV reverse transcriptase sao chép ngƣợc tạo ra cDNA (trong đó bao gồm các trình tự đoạn khởi động của T7 RNA Polymerase) trình tự đích. T7 RNA Polymerase tạo nhiều bản sao của RNA amplicon từ cDNA.
Trần Vân Chi 44 Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Hình 2.5: Nguyên lý khuếch đại TMA
Bƣớc 3: Phát hiện sản phẩm khuếch đại: bởi phƣơng pháp bảo vệ quá trình lai bởi
HPA (Hybridization Protection Assay) sử dụng probe gắn hóa chất phát quang Acridinium Ester (AE) đƣợc bảo vệ khỏi môi trƣờng kiềm khi gắn với sản phẩm lai. Hóa chất phát quang AE trong probe khơng gắn đƣợc với sản phẩm lai sẽ bị phá hủy trong môi trƣờng kiềm. Probe gắn với sản phẩm lai sẽ đƣợc phát hiện bởi máy đo tín hiệu phát quang.
Trần Vân Chi 45 Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Hình 2.6: Phản ứng động học DKA qua tín hiện AE
Nhận định kết quả: Kết quả máy đọc cho ra trên giá trị mẫu đƣợc coi là phản ứng với
HIV-RNA hoặc HBV-DNA hoặc HCV-RNA hoặc có thể nhiễm 2 trong 3 vi rút hoặc nhiễm cả 3 vi rút. Mẫu sẽ đƣợc xét nghiệm đơn để tìm ra mẫu nào có phản ứng. Mẫu phản ứng đƣợc lấy từ túi máu xét nghiệm kiểm tra lại. Nếu mẫu này có phản ứng đƣợc tiếp tục xét nghiệm phân biệt: với HBV-DNA, HCV-RNA hay HIV-RNA.
2.3.2.2. Kỹ thuật NAT Realtime PCR (theo quy trình kỹ thuật của hãng Roche)
Nguyên tắc: NAT Realtime PCR là một phƣơng pháp khuếch đại acid nucleic phát
hiện trực tiếp HIV-RNA, HBV- DNA, HCV- RNA.
Quy trình thực hiện nhƣ sau:
Tách chiết axit nucleic sử dụng COBAS® AmpliPrep Instrument
Axit nucleic từ các trình tự đích và thêm phân tử Armored RNA chứng nội(IC) đƣợc xử lý đồng thời. Các TaqScreen MPX Test trên COBAS®AmpliPrep Instrument thực hiện tuần tự theo 4 bƣớc:
Bƣớc 1: Ly giải và ổn định mẫu. Dung dịch proteinase phân hủy protein. Dung dịch ly giải phá vỡ cấu trúc vi rút, bất hoạt nucleases giải phóng RNA và DNA từ các hạt vi rút.
Trần Vân Chi 46 Luận văn Thạc sÜ Khoa häc
Bƣớc 2: Bắt giữ nucleic acid: RNA và DNA giải phóng đƣợc bám vào bề mặt silica của hạt Magetic Glass Particles trong môi trƣờng giàu muối và ái lực cao ở 370C. Các axit nucleic đƣợc giải phóng liên kết với các bề mặt silica bằng việc thêm hạt Magnetic Glass. Các điện tích dƣơng trên bề mặt hạt thủy tinh gắn điện tích âm của các axit nucleic dƣới nồng độ muối chaotropic và cƣờng độ ion của phản ứng ly giải.
Bƣớc 3: Tinh sạch: Nƣớc rửa loại bỏ các chất không liên kết và các tạp chất nhƣ protein biến tính, mảnh vỡ tế bào và các chất có khả năng ức chế PCR (nhƣ hemoglobin, vv), và giảm nồng độ muối. Việc xoay của bánh xe từ giúp cho quá trình rửa bằng cách làm cho MGP di chuyển lên xuống. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bƣớc 4: Hịa trộn và giải phóng axit nucleic: Cho Elution Buffer vào ủ nhiệt độ 800C axit nucleic tinh khiết đƣợc giải phóng từ hạt Glass từ tính.
Khuếch đại tự động axit nucleic sử dụng COBAS® TaqMan® Analyzer
Sau khi axit nucleic của vi rút đƣợc tách chiết, Cobas® TaqScreen MPX Master Mix (MPX2 MMX) khuếch đại và phát hiện HIV-1 (Nhóm M, Nhóm O), HIV-2 và HCV RNA, DNA HBV và IC RNA. Mangan acetate kích hoạt, Cobas® TaqScreen MPX Master Mix cho phép phiên mã ngƣợc (RNA đích), khuếch đại PCR vùng bảo tồn cao của HIV-1 (nhóm M, nhóm O), HIV-2 và HCV RNA, DNA HBV sử dụng mồi đặc hiệu IC RNA . Phát hiện các axit nucleic khuếch đại đƣợc thực hiện bởi các tín hiệu huỳnh quang từ 5'- nucleolytic suy biến/ thối hóa của HIV-1 (nhóm M và O), HIV-2, HCV, HBV và IC dò. Bốn thuốc nhuộm huỳnh quang đƣợc sử dụng: một loại thuốc nhuộm đánh dấu IC, và ba loại thuốc nhuộm khác gắn mồi HIV, HCV và HBV, cho phép xác định độc lập của HIV, HCV và HBV đích, và IC.
Phiên mã ngƣợc và khuếch đại PCR
Phiên mã ngƣợc và khuếch đại PCR đƣợc thực hiện với một enzyme tái tổ hợp chịu nhiệt, Z05D DNA Polymerase. Sự có mặt của Mangan (Mn2 +), Z05D DNA
Trần Vân Chi 47 Luận văn Thạc sÜ Khoa häc
Polymerase dịch mã ngƣợc và hoạt động nhƣ polymerase DNA. Chất này cho phép cả phiên mã ngƣợc và khuếch đại PCR cùng xảy ra trong một phản ứng.
Khuếch đại PCR đƣợc diễn ra với việc dùng Z05D DNA Polymerase kéo dài đoạn axit nucleic cần nhân lên khi ủ cùng với các trình tự mồi tƣơng thích để tạo ra DNA (bản sao). Q trình này đƣợc lặp lại cho nhiều chu kỳ, với mỗi chu kỳ tăng gấp đôi số lƣợng sản phẩm DNA phiên mã. Phản ứng PCR chỉ khuếch đại đoạn gen tƣơng ứng với các mồi; tồn bộ gen của vi rút khơng đƣợc khuếch đại.
Khuếch đại có chọn lọc
Khuếch đại có chọn lọc các axit nucleic khn bằng TaqScreen MPX sử dụng các enzym AmpErase (uracil-N-glycosylase) và deoxyuridine triphosphat (dUTP). Các enzyme AmpErase nhận ra và xúc tác phá hủy sợi DNA có chứa deoxyuridine, nhƣng khơng phải DNA có chứa deoxythymidine hoặc RNA chứa ribouridine. Deoxyuridine khơng có mặt trong DNA tự nhiên, nhƣng ln ln hiện diện trong sản phẩm khuếch đại vì trong thuốc thử MPX2 Master Mix sử dụng các deoxyuridine triphosphate với thymidine triphosphate nhƣ một dNTP; do đó, chỉ sản phẩm khuếch đại chứa deoxyuridine. Các enzyme AmpErase phá hủy sản phẩm khuếch đại nhiễm trƣớc khi khuếch đại DNA khn. Ngồi ra, các enzyme AmpErase (uracil-N- glycosylase) phá hủy bất kỳ sản phẩm không đặc hiệu đƣợc tạo thành sau bƣớc đầu hoạt động của Master Mix bởi Manganese. Các enzym AmpErase (uracil –N- glycosylase), có trong thuốc thử MPX2 Master Mix, xúc tác sự phân cắt của DNA chứa deoxyuridine tại vị trí deoxyuridine dƣ thừa bằng cách mở các chuỗi deoxyribose tại vị trí C1. Khi làm nóng trong bƣớc luân nhiệt đầu tiên, nhiệt độ phá vỡ chuỗi DNA lai ở vị trí deoxyuridine, do đó các DNA khơng thể phiên mã. Các enzyme AmpErase (uracil-N-glycosylase) không hoạt động trong một thời gian dài sau khi tiếp xúc với nhiệt độ trên 55ºC và do đó sẽ khơng phá hủy sản phẩm khuếch đại hình thành sau phản ứng PCR.
Trần Vân Chi 48 Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phát hiện các sản phẩm PCR sử dụng Cobas TaqMan Analyzer.
Khi khuếch đại PCR, nhiệt độ cao liên tục ở chu kỳ biến tính để đoạn gen cần nhân và IC phân tách thành DNA sợi đơn. Đầu dò oligonucleotide phát hiện đặc hiệu lai với chuỗi DNA sợi đơn để tạo thành sản phẩm DNA khuếch đại. Lai và phát hiện xảy ra đồng thời.
Phát hiện sản phẩm PCR
Các TaqScreen MPX Test Master Mix chứa đầu dò phát hiện đặc hiệu HIV-1 (Group M, O), HIV-2, HCV, HBV hoặc IC axit nucleic. Mỗi đầu dò phát hiện đƣợc gắn chất đánh dấu với:
1. một loại thuốc nhuộm huỳnh quang khô mà hoạt động nhƣ một kênh đọc. 2. một loại thuốc nhuộm khơ khác có tác dụng nhƣ một tín hiệu dập tắt.
Một tín hiệu đặc hiệu gắn đến đầu dị đặc hiệu viral đƣợc đo bằng 1 bƣớc sóng xác định. Một tín hiệu thứ hai gắn với mồi IC đặc hiệu và đƣợc đo bằng bƣớc sóng khác. Một loại tín hiệu dập tắt đơn đƣợc sử dụng trong tất cả các đầu dò. Hệ thống này cho phép phát hiện đồng thời và phân biệt với cả các trình tự đích vi rút ở bƣớc sóng, và IC ở một bƣớc sóng khác.
Trƣớc khi bắt đầu khuếch đại PCR, các đầu dị khơng hoạt động và các kênh đọc huỳnh quang bị ức chế bởi tín hiệu dập tắt do kiểu truyền năng lƣợng Fưrster. Trong q trình khuếch đại PCR, các mồi lai đặc hiệu với các sợi DNA đơn đƣợc phân cắt bởi hoạt động nuclease 5 'đến 3' của Z05D DNA Polymerase thực hiện đồng thời với quá trình khuếch đại. Một kênh đọc và tín hiệu dập tắt đƣợc chia ra bởi sự phân cách, hoạt động phát huỳnh quang của kính đọc khơng đƣợc che lại. Với mỗi chu kỳ PCR, tăng số lƣợng mồi và tín hiệu đánh dấu đƣợc tạo ra tăng lên đồng thời.
Phát hiện thời gian thực và xác định sản phẩm PCR đƣợc thực hiện bằng cách đo sự phát huỳnh quang của các thuốc nhuộm phát hiện các viral đích và IC độc lập.
Trần Vân Chi 49 Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Nhận định kết quả:
Giá trị chu kỳ ngƣỡng CT (cycle of threshold) thu đƣợc là giá trị của số chu kỳ mà sản phẩm PCR đạt đến một giá trị xác định ở dãy tuyến tính. Nhƣ vậy, các phản ứng sử dụng ADN khn có nồng độ càng cao thì giá trị CT càng thấp. Do đó, phƣơng pháp Real Time-PCR để đánh giá độ nhạy của phƣơng pháp phát hiện HIV, HBV và HCV dựa trên giá trị CT thu đƣợc.
Quản lý dữ liệu NAT tự động bằng phần mềm PDM
Phần mềm PDM Roche cho phép ngƣời sử dụng xem xét và báo cáo kết quả. Các phần mềm Roche PDM gán kết quả xét nghiệm cho tất cả các xét nghiệm nhƣ không phản ứng, phản ứng hoặc không hợp lệ. Ngoài lấy và kiểm tra kết quả PCR, phần mềm PDM Roche cho phép ngƣời sử dụng in kết quả, tìm kiếm kết quả, chấp nhận kết quả, và tùy chọn chuyển kết quả đến một mạng nội bộ (LIS)