Năm 2006, Huang Anli và cộng sự công bố patent sử dụng urea kết hợp với hợp chất pyridineamineone 7 để tạo vịng pyridine pyrimidine. [11]
Hình 1.12: Phương pháp của Huang Anli và cộng sự
Phương pháp của Huang Anli và cộng sự tuy không sử dụng tác nhân cyanamide nhưng phải thêm bước và hiệu suất toàn phần thấp vì thế cũng khó để áp dụng cho sản suất lượng lớn.
Năm 2008, Liu Xing và các cộng sự [15] công bố cải tiến bước tổng hợp nhóm benzamide bằng phản ứng trực tiếp giữa acid với amine sử dụng tác nhân kết hợp N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethyl-carbodiimide (EDC) cho hiệu suất phản ứng 76% cũng đáng chú ý.
Hình 1.13: Phương pháp cải tiến bước tổng hợp nhóm benzamide của Liu Xing và cộng sự
Phương pháp của Wang C. L. và Cộng sự: [16]
Năm 2008, Wang C. L. và cộng sự đã tổng kết lại các phương pháp tổng hợp của Zimmermann, Loiseleur, Compella và Srakacs và đưa ra qui trình tổng hợp imatinib khơng sử dụng tác nhân độc hại cyanamide trong bước tổng hợp vòng pyrimidine. Hợp chất enaminone 7 đã được tổng hợp bằng phản ứng trực tiếp giữa
3-acetylpyridine với tác nhân formyl hóa N,N-dimethylformamide dimethyl acetal cho hiệu suất cao 92,6% [17, 27]. Sản phẩm enaminone 7 được ngưng tụ đóng vịng với guanidine nitrate để cung cấp hệ vòng dị tố pyridinepyrimidine 20. Phản ứng kết hợp tiếp theo giữa nhóm amine của pyrimidine 20 với phenylbromide tạo liên
kết N-C đã được thực hiện dưới điều kiện phản ứng Ullmann [4, 5, 9, 14, 23] sử dụng xúc tác CuI với ligand N,N’-dimethylethylenediamine cho hợp chất trung gian N–(2-methyl-5-nitrophenyl)-4-(pyridin-3-yl)pyrimidine-2-amine 8 với hiệu suất
82%. Trong phản ứng khử nhóm nitro, các điều kiện khử tốn kém, sử dụng H2/ Pd/C hay H2/Pt/C đã được thay bằng tác nhân khử hydrazine/FeCl3 với hiệu suất 83,8%. Phản ứng acyl hóa nhóm amine tiếp theo cung cấp nhóm benzamide xảy ra dễ dàng với hiệu suất 93% . Cuối cùng là phản ứng kết hợp của alkylchloride 12 với
piperazine cho hiệu suất 91,4%. Như vậy hiệu xuất tồn phần của quy trình vào khoảng 40% tính theo 3-acetylpyridine.
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu
Qua phân tích các phương pháp tổng hợp imatinib mesylate trên thế giới chúng tôi thấy: Phương pháp của Wang và cộng sự đáp ứng được các yêu cầu môi trường và hiệu suất tồn phần của qui trình (khoảng 40% tính theo 3-acetyl pyridine). Hơn nữa, các sản phẩm phụ của các bước đều có thể kiểm sốt được. Vì vậy phương pháp của Wang và cộng sự được chúng tôi sử dụng nghiên cứu tổng hợp imatinib mesylate. Các bước tổng hợp liên quan đến các phản ứng cộng loại lưỡng phân tử tạo vòng pyridinepyrimidine, phản ứng Ullmann tạo liên kết C-N, phản ứng khử nhóm nitro thơm thành amine, phản ứng acyl hóa amine và phản ứng amine hóa alkylhalide.
2.1.1. Các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ
2.1.1.1. Phƣơng pháp tổng hợp vòng dị tố pyrimidine
Con đường chung nhất và được áp dụng rộng rãi nhất để tổng hợp vòng dị tố pyrimidine là dựa vào sự kết hợp của các tác nhân chứa khung N-C-N với tác nhân chứa các đơn vị C-C-C. Phương pháp tổng hợp dị tố này được gọi là 2 ái nhân cộng với 2 ái electron (double nucleophile plus double electrophile), trong đó, cả 2 nguyên tử nitơ của tác nhân N-C-N hành xử như nucleophile còn tác nhân C-C-C hành xử như electrophile. Thông thường các tác nhân urea, thiourea và guanidine được sử dụng như tác nhân N-C-N còn những dẫn xuất ketone hay axit α, β-không no được sử dụng như tác nhân C-C-C ( Hình 4.4).
2.1.1.1. Phản ứng Ullmann
Phản ứng Ullmann cổ điển là phản ứng thế nucleophile vòng thơm qua trung gian Cu, là phản ứng kết hợp arylhalide với Cu hình thành biaryl. Phản ứng Ullmann cổ điển đã được phát triển cho việc hình thành các liên kết aryl amine (C- N), aryl ete ( C-O), hoặc aryl thio ete C-S) được gọi là phản ứng ngưng tụ Ullmann, phản ứng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ cao và thời gian phản ứng kéo dài.
Phản ứng Ullmanncổ điển đã phát triển thành phản ứng “Ullmann –type” với việc thay xúc tác Cu bằng xúc tác Pd hoặc thêm các ligand để tăng độ hòa tan của xúc tác Cu, phản ứng xảy ra ở điều kiện êm dịu hơn và thời gian phản ứng ngắn hơn.
Phản ứng khử hợp chất nitro thơm về amine thơm
Ar-NO2 Ar-NH2
Phản ứng acyl hóa amine thơm
ArNH2 + RCOCl RCONHAr
Phản ứng amine hóa alkylhalide
R1CH2Cl + R2NH R1NR2
2.1.2.Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng, phân lập và tinh chế sản phẩm
Các phương pháp sắc ký: sắc ký là một phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Sự tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào 2 pha (không trộn lẫn) luôn luôn tiếp xúc nhưng không trộn lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động.
Quá trình sắc ký gồm 3 giai đoạn chính: + Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh.
+ Cho pha động chạy qua pha tĩnh. + Phát hiện các chất.
Phương pháp phân tích sắc ký có thể được phân loại thành 2 loại chính, bao gồm: - Sắc ký lỏng: lỏng - lỏng, lỏng - rắn.
- Sắc ký khí: khí - lỏng, khí - rắn.
Phương pháp sắc ký hay được dùng phổ biến trong phân lập hợp chất hữu cơ là sắc ký lỏng - rắn: sắc ký bản mỏng và sắc ký cột.
a. Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC)
Sắc ký lớp mỏng là phương pháp nghiên cứu hiệu quả để phân tích và xác định số lượng các chất khác nhau có trong đối tượng nghiên cứu. Dựa trên nguyên tắc các chất khác nhau có độ phân cực khác nhau nên tách ra ở những vị trí khác nhau. Đây là phương pháp phân tích vi lượng, hiệu quả tách cao và thời gian thực hiện ngắn.
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel Merck 60 F254, dày 0,25mm, sử dụng các dung mơi có độ phân cực khác nhau để khảo sát và chọn ra một hệ tách tốt nhất dùng cho sắc ký cột.
Các vệt chất được phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại (λ = 254 nm và λ = 366 nm) và dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2, tiếp theo là hơ nóng ở nhiệt độ cao.
Đối với sắc ký bản mỏng, việc lựa chọn dung môi hay hệ dung môi cho độ phân tách tốt là quan trọng nhất. Cụ thể với các yêu cầu khảo sát thì chọn dung mơi sao cho các vệt tròn, sắc nét, rải đều trên tồn bản mỏng và có Rf càng xa nhau càng tốt.
Bình triển khai : là bình thủy tinh có nắp đậy kín, có thể sử dụng các loại bình triển khai có kích thước khác nhau phù hợp với kích thước bản mỏng chạy sắc ký. Dưới đây là hình ảnh bình chạy sắc ký bản mỏng
b. Sắc ký cột
Sau khi khảo sát sắc ký bản mỏng, tiến hành sắc ký cột để tinh chế mẫu nghiên cứu. Sắc ký cột là phương pháp thường được sử dụng để phân tách các chất tuỳ theo các tính chất hóa lý của chúng. Có 3 phương pháp sắc ký cột thơng thường:
- Column Chrotomatography (CC): sắc ký cột thường. - Flash Chrotomatography (FC): sắc ký cột nhanh.
- Medium Pressure Liquid Chrotomatography (MPLC): sắc ký lỏng trung áp.
2.1.3. Phƣơng pháp pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ a. Phổ hồng ngoại (Infrared - IR) a. Phổ hồng ngoại (Infrared - IR)
Các nhóm chức trong các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong các vùng từ 10000 đến 100 cm-1 (1-100µm) và biến thành dao động của phân tử.
Sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại có định lượng nhưng phổ hồng ngoại không biểu hiện thành các đường thẳng mà là các dải hấp thụ với cường độ khác nhau bởi vì sự biến đổi năng lượng dao động luôn đi kèm với sự biến đổi năng lượng dao động quay.
Phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ 2 dạng năng lượng đó là năng lượng dao động và năng lượng quay.
Tần số hay độ dài sóng hấp thụ của mỗi chất phụ thuộc vào khối lượng tương đối của các nguyên tử, hằng số lực các dãy nối và cấu trúc hình học của nguyên tử.
Như vậy, phổ hồng ngoại cho phép nhận biết sự có mặt của các nhóm chức có trong phân tử hợp chất nghiên cứu, dựa vào cực đại hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức đó.
Phổ hồng ngoại được ghi trên máy đo hồng ngoại biến đổi Fourier hiệu FTIR Impact - 410 bằng phương pháp nén KBr.
b. Phổ tử ngoại (UV-VIS)
Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại và khả kiến phụ thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử. Sự hấp thụ ấy gây ra sự chuyển dịch các điện tử từ obitan ở trạng thái
cơ bản lên obitan có năng lượng cao hơn ở trạng thái kích thích. Chỉ có một số dạng cấu trúc trong hợp chất hữu cơ mới có sự hấp thụ ấy nên trên thực tế phổ tử ngoại cũng chỉ giới hạn trong một số hợp chất, chủ yếu là các chất có cấu trúc liên kết π liên hợp. Đặc điểm của phổ tử ngoại là phổ của một chất phức tạp có thể giống với phổ của một chất đơn giản nếu 2 chất ấy cùng chứa một nhóm cấu trúc giống nhau.
c. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance, viết tắt là NMR) là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợp chất hố học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi được đặt trong một từ một phân tử là độ chuyển dịch hoá học δ và hằng số tương tác spin – spin J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM 500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam với TMS (Tetrametylsilan) là chất chuẩn nội.
d. Phổ khối lƣợng (Mass spectrometry- MS)
Phổ khối lượng là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử [M]+, [M+H]+, [M-H]- ..., từ đó giúp ta xây dựng cơng thức phân tử.
Phổ khối lượng được đo bằng phương pháp ESI trên máy Agilent 1120 tại Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Dựa trên phương pháp của Wang và cộng sự, những nội dung chính thực hiện đề tài bao gồm:
- Nghiên cứu tổng hợp nguyên liệu đầu: 3-(dimethylamino)-1-(pyridin-3-yl)prop-2- en-1-one ; 4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine.
- Nghiên cứu tổng hợp các hợp chất trung gian : N-(2-methyl-5-nitrophenyl)-4-(pyridin- 3-yl)-2-amine; 6-Methyl-N-(4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-yl)benzene-1,3-diamine; 4-(Chloromethyl)-N-(4-methyl-3-(4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)phenyl)benzamide.
- Nghiên cứu qui trình tổng hợp imatinib base.
- Nghiên cứu quy trình tổng hợp imatinib mesylate từ imatinib base.
- Xác định cấu trúc các hợp chất đã tổng hợp bằng phương pháp phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng hạt nhân, và phổ khối lượng.
- Xác định hàm lượng imatinib mesylate của sản phẩm cuối bằng phương pháp HPLC.
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và thiết bị 2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1 Hóa chất
- Nguyên liệu được sử dụng trong các quy trình bao gồm 3-acetylpyridine, DMF-DMA, guanidine nitrate Gua.NO3, DMEDA, 4-(chloromethyl)benzoyl chloride, 1-methylpiperazine, methansulfonic acid , Xúc tác Ni Raney xuất xứ Merck hoặc Aldrich; NaOH, K2CO3, CuI, FeCl3, C, N2H4.H2O, Fe, Zn xuất xứ Trung Quốc.
- Dung môi sử dụng: xylene, n-butanol, dioxane, n-hexane, methanol, ethylacetate, etanol, aceton, dichloromethane xuất xứ từ Trung Quốc. Tất cả các dung mơi sử dụng là hố chất công nghiệp và được tinh chế tại phịng thí nghiệm trước khi sử dụng.
- Thuốc thử: Ce(SO4)2
- Bản mỏng Silicagel 60F254 (Merck - Đức).
2.1.2 Dụng cụ thiết bị
- Dụng cụ thuỷ tinh: cốc, lọ, ống hút, bình cầu, bình quả nhót, ống đong 5mL, 10mL, 50mL, 100mL,….
- Cột sắc ký cỡ Ф 10mm, 20mm, 25mm, 30mm, cột sephadex. - Máy cất quay chân không Buchi waterbath B-480.
- Tủ sấy Memmert.
- Cân phân tích 4 số Model: CP224SSartorius -Đức.
- Đèn tử ngoại Desaga (Đức) - bước sóng 254nm và 366nm. - Điểm nóng chảy được đo trên máy Boetius.
- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy FTIR Impact- 410 theo phương pháp nén viên KBr hoặc Film.
- Phổ tử ngoại khả kiến (UV- VIS) được đo trên máy Cintra 40.
- Phổ khối phun mù electron (ESI-MS) được đo trên máy ghi phổ khối Agilent 1100. - Phổ khối phân giải cao (FT-ICR-MS) được đo trên máy Varian 910.
- Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz với TMS là chất chuẩn nội.
3.2. Tổng hợp nguyên liệu đầu
3.2.1. Tổng hợp 3-(dimethylamino)-1-(pyridin-3-yl)prop-2-en-1-one (1)
Quy trình chung: Trong một bình 3 cổ đáy trịn có lắp máy khuấy, sinh hàn
ngưng tụ, lần lượt cho 3-acetylpyridine (AcPy) (1,1 mL,10 mmol, 1,21 g, 14 eqv.); DMF-DMA (2,7 mL, 20 mmol, 2,38 g; 2 eqv.); xylene (3,5 mL (1 mmol acetylpyridine/0,35 mL xylene). Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu ở 140oC trong khoảng 6-10 giờ (phụ thuộc vào lượng tác nhân). Kiểm tra SKLM, sau khi chất đầu biến mất trên bản mỏng thì dừng phản ứng. Sau đó cất loại methanol sinh ra trong quá trình phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được làm lạnh đến nhiệt độ phòng, n-hexane đã được thêm vào và được khuấy khoảng 20 phút, sản phẩm kết tủa được lọc và rửa với n-hexane. Cặn thô đã được kết tinh lại từ xylene cho 1,6 g sản phẩm màu vàng với hiệu suất ~92%.
Khảo sát các điều kiện phản ứng:
Phản ứng tổng hợp hợp chất 3-(dimethylamino)-1-(pyridin-3-yl)prop-2-en-1- one (7), đã được khảo sát các yếu tố về: Tỉ lệ mol các tác nhân AcPy/DMF-DMA (Bảng 1) và lượng dung môi phản ứng (Bảng 2). Các kết quả thu được được trình bày trong các Bảng 1 và Bảng 2
Bảng 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ mol tác nhân AcPy/DMF-DMA đến hiệu suất phản ứng STT AcPy (M=121) (mol) DMF-DMA (M=119) (mol) Tỉ lệ mol AcPy/DMF- DMA Xylene (mL) tpƣ (giờ) H (g/%) 1 0,01 0,01 1:1 3,5 6 1,32/75 2 0,01 0,015 1:1,5 3,5 6 1,5/85 3 0,01 0,02 1:2 3,5 6 1,62/92 4 0,01 0,025 1:2,5 3,5 7 1,62/92 5 0,01 0,03 1:3 3,5 7 1,63/92,5
Bảng 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng dung môi đến hiệu suất phản ứng
STT AcPy (M=121) (mol) DMF-DMA (M=119) (mol) Tỉ lệ mol AcPy/DMF-DMA Xylene (ml) tpƣ (giờ) H (g/%) 1 0,01 0,020 1:2 2 6 1,5/85 2 0,01 0,020 1:2 3 6 1,53/87 3 0,01 0,020 1:2 3,5 6 1,62/92 4 0,01 0,020 1:2 4 6 1,61/91,5 5 0,01 0,020 1:2 4,5 6 1,62/92
Các kết quả thu được trong Bảng 1, Bảng 2 cho thấy, tỉ lệ mol của các tác nhân (AcPy/DMF-DMA) là (1/2) (mol/mol) với lượng dung môi tương ứng là 1mmol AcPy sử dụng 3,5 mL xylene cho hiệu suất cao nhất là 92%.
Chất 7: là sản phẩm màu vàng Tnc= 79-80 oC
FT-IR (KBr) νmax (cm-1): 3419, 2922, 1639, 1587, 1527, 1363, 1251, 1067, 901,
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 9,09 (1H, d, J = 1,6 Hz); 8,68 (1H, dd, J = 1,6, 4,5 Hz); 8,21 (1H, m); 7,85 (1H, d, J = 12,2 Hz); 7,37 (1H, dd, J = 4,9; 7,9 Hz); 5,69 (1H, d, J = 12,2 Hz); 3,19 (3H, s); 2,96 (3H, s). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): 186,2; 154,6; 151,3; 148,7; 135,7; 135,2; 123,3; 91,8; 45,2; 37,4. ESI-MS m/z: 177[M+H]+. 3.2.2 Tổng hợp 4-(Pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine (21)
Quy trình chung: Trong bình một cổ đáy trịn lắp máy khuấy và sinh hàn
ngưng tụ được nạp lần lượt các chất 3-(dimethylamino)-1-(pyridin-3-yl)prop-2-en- 1-one (7) (1,76 g, 0,01 mol), guanidine nitrate (0,01 mol, 1,22 g), NaOH (0,01 mol, 0,4 g), n-butanol (12,5 mL). Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu trong khoảng 12 giờ đến phản ứng kết thúc (kiểm tra SKLM), sau đó được để nguội đến nhiệt độ phịng, kết tủa hình thành được lọc, rửa với nước, sấy khô ở 75-80oC thu được 1,46 g sản phẩm tinh thể màu trắng với hiệu suất 85%.
Khảo sát các điều kiện phản ứng:
Hợp chất 4-(Pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine 21 được tổng hợp theo quy trình
trên và được khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng như: - Tỉ lệ mol của các tác nhân 7/GuaNO3 (Bảng 3)
- Lượng NaOH ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng (Bảng 4)