Thời gian (Phút) Pha động A Pha động B 0 100 0 17 100 0 27 30 70 27,1 100 0 35 100 0
* Tiến hành: Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống sắc ký. Tiến hành sắc ký đối
với dung dịch chuẩn. Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích píc imatinib mesylate trong 6 lần tiêm lặp lại không quá 2,0 %. Hệ số đi của píc imatinib mesylat khơng lớn hơn 1,5. Số đĩa lý thuyết không dưới 1500. Tiến hành sắc ký đối với cả dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Quy trình tổng hợp imatinib mesylate đƣợc thực hiện theo hình sau:
Các sản phẩm trung gian được tổng hợp theo các quy trình đã được nghiên cứu trong phần thực nghiệm. Các điều kiện phản ứng ở mỗi bước phản ứng đã được khảo sát để đạt được hiệu suất cao nhất như các kết quả được trình bày trong các bảng từ Bảng 1 đến Bảng 18. Các điều kiện tối ưu cho mỗi bước phản ứng đã được nghiên cứu là:
* Bước I: (AcPy/DMF-DMA) (1/2, mol/mol) và lượng dung môi tương ứng 1 mol AcPy là 3,5 mL xylene.
* Bước II: (7/GuaNO3/NaOH) (1/1/1) (mol/mol/mol) trong lượng dung môi là 1 mmol tác nhân 7/12,5
* Bước III: (21/23/CuI/DMEDA/K2CO3) (1,1/1,0/0,25/0,25/2,0) (mol/mol/mol/mol) và lượng dung môi tương ứng 1 mol chất 23 dùng 5L dioxane.
* Bước IV: tỉ lệ mol các tác nhân phản ứng là Chất 8/N2H4.H2O/FeCl3/C (1/2/0,015/1,6) (mol/mol). * Bước V: tỉ lệ mol các tác nhân và xúc tác như: chất 9/chất a/TEA (1/0,9/2) (mol/mol/mol).
* Bước VI: Tỉ lệ mol chất 12/MPP(1/10) (mol/mol) ở 130 oC trong thời gian 1,5 giờ. * Bước VII: tỉ lệ mol chất 2/methansulfonic acid/etanol (10/10/0,86) (mol/mol/mol)
Bảng 20: Các hợp chất tổng hợp được STT CTCT CTPT KLPT T o nc (OC) Hiệu suất 1 C9H9N2O 177 79-80 92 2 C9H8N4 172 188-191 85 4 C16H13N5O2 307 193-194 81 5 C16H15N5 277 139-142 87 6 C24H20ClN5O 429 266-268 87 7 C29H31N7O 493 208-210 85 8 C30H35N7O4S 589 214-224 90
4.1. Quy trình tổng hợp nguyên liệu đầu
4.1.1. Hợp chất 3-(Dimethylamino)-1-(pyridin-3-yl)prop-2-en-1-one (7)
Hợp chất enaminone 7 được tổng hợp từ 3-acetyl pyridine phản ứng với tác nhân DMF-DMA trong xylene đun hồi lưu, sau khi phản ứng kết thúc hỗn hợp đã được cất loại dung môi và sản phẩm phụ của phản ứng (MeOH sinh ra từ phản ứng). Các điều kiện phản ứng về tỉ lệ mol các tác nhân, lượng dung môi phản ứng đã được khảo sát, các kết quả khảo sát được trình bày trong các bảng 1 và bảng 2. Từ kết quả khảo sát đã tìm được điều kiện phản ứng cho hiệu suất cao giữa tỉ lệ mol giữa các tác nhân và dung môi là (AcPy/DMF-DMA) (1/2) (mol/mol) trong 3,5 mL xylene. Hợp chất DMF-DMA là tác nhân hữu ích trong rất nhiều phản ứng hữu cơ, nó đóng vai trị như một tác nhân formyl hóa. Khả năng phản ứng của tác nhân này do sự tạo thành ion carbenium aza-oxo bền vững, carbenium này ngưng tụ với nhóm methylene có H-axit của acetylpyridine loại đi một phân tử MeOH. Sau đó dưới tác dụng của nhiệt hợp chất trung gian này loại tiếp đi một phân tử MeOH nữa để hình thành hợp chất enaminone 7.
Cấu trúc hóa học của enaminone 7 đã được khẳng định bằng các phương pháp phổ. Theo đó, phổ 1
H-NMR của 7 cho các tín hiệu của 4 proton pyridine ở δ9,09(d, 1H), 8,68-8,67(m, 1H), 8,21 (1H, m); 7,37 (1H, dd), 2 proton nối đơi ngoại vịng tại δH 7,85 (d, J = 12,2 Hz, 1H) và 5,69 (d, J = 12,2 Hz, 1H) và tín hiệu của 2 nhóm N-
CH3 tại δH 3,19 và 2,96. Phổ 13C-NMR cho tín hiệu của 10 cacbon hồn tồn phù hợp cấu trúc phân tử của 7 gồm 1 tín hiệu của nhóm ketone ở δ 186 và 7 tín hiệu của cacbon vịng thơm và nối đơi tiếp đó là 2 tín hiệu của 2 nhóm methyl ở δ45 và δ 37. Phổ khối của hợp chất này cũng cho pic ion giả phân tử m/z: 177[M+H]+
phù hợp với trọng lượng phân tử chất 7.
4.1.2. Hợp chất 4-(Pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine (21)
Hợp chất 4-(Pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine 21 đã được điều chế bằng phản ứng đóng vịng của enaminone 7 với guanidine nitrate trong n-butanol với sự có mặt của NaOH cho phép nhận được mảng cấu trúc thứ nhất pyridinepyrimidine aminevới hiệu suất 81%.
Guanidine nitrate là dạng muối axit được hình thành từ guanidine và axit nitric, khi ở dạng muối axit phân tử bền hơn nên thường được sử dụng trong thương mại. Trong phản ứng, axit được trung hòa bởi kiềm để phân tử trở về dạng trung tính và tham gia phản ứng. Guanidine có các dạng cộng hưởng trong mơi trường trung tính và mơi trường axit như trong hình 4.3:
Hình 4.3: Các cấu trúc cộng hưởng của guanidine trung tính và trong axit
Phản ứng đóng vịng dị tố pyrimidine xảy ra theo cơ chế cộng loại liên hợp, lưỡng nucleophile cộng hợp với lưỡng electrophile. Tác nhân nucleophile (các nhóm amine của guanidine mảng N-C-N ) tấn công vào các cacbon dương điện ái
electrophile của enaminone (mảng C-C-C). Một quá trình cộng loại liên tiếp xảy ra để hình thành vịng dị tố pyridinepyrimidine được trình bày trong hình 4.4:
Hình 4.4: Cơ chế phản ứng đóng vịng dị tố pyrimidine
Cấu trúc hóa học của sản phẩm đóng vịng dị tố pyridinepyrimidine amine 21 được thể trên các tín hiệu phổ NMR và phổ khối ESI-MS (Hình 12, Hình 13, Hình 14) và các số liệu phổ tại phần thực nghiệm. Trên phổ 1H-NMR của 21 cho 6 tín hiệu proton thơm của vòng pyridine và vòng pyrimidine ở δ 9,16(d, 1H), δ 8,67(dd, 1H), δ 8,37(d, 1H), từ 8,36-8,33 ppm (m, 1H) , δ 7,49(dd, 1H), và ở δ7,08(d, 1H) ngồi ra cịn tín hiệu tù của nhóm amine ở 3,83 ppm. Phổ 13C-NMR của chất 21 cũng chỉ ra 9 tín hiệu của 9 cacbon của 2 vịng pyridine và vịng pyrimidine. So sánh tín hiệu phổ NMR của 7 với 21 cho thấy, tín hiệu của nhóm ketone và 2 nhóm N-methyl đã được thay thế bởi tín hiệu của 2 cacbon sp2 tại δC 163,0 và 162,9. Các tín hiệu này hồn tồn phù hợp với sự hình thành vịng pyrimidine. Điều này đã được khẳng định bằng phổ khối lượng ESI-MS của 21 với pic ion phân tử proton hóa tại m/z 173 [M+H]+.
Hình 4.5: Phổ 1H-NMR của hợp chất 21
4.2. Quy trình tổng hợp các sản phẩm trung gian
4.2.1. Hợp chất N-(2-methyl-5-nitrophenyl)-4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine (8)
Phản ứng N-aryl hóa của pyridinepyrimidine amine 21 với 2-bromo-1-
methyl-4-nitrobenzene 23 tạo thành hợp chất trung gian chìa khóa N-(2-methyl-5-
được cải tiến thay xúc tác Pd/C bằng xúc tác CuI và sử dụng DMEDA làm phối tử với sự có mặt của basơ K2CO3 đạt được hiệu suất đến 75%.
Cơ chế của phản ứng gồm các bước: 2-bromo-1-methyl-4-nitrobenzen 23
kết hợp với CuI tạo ra phức của đồng 23a nhờ phản ứng cộng oxi hóa. Phức 3a tách khử để tạo ra hợp chất 23b và CuBr. Hợp chất 23b và 21 cộng hợp để tạo ra hợp
chất 8, đồng thời hoàn nguyên lại xúc tác CuI.
Hình 4.6: Cơ chế của phản ứng tổng hợp hợp chất 8 phản ứng “Ullmann-type”
Cấu trúc hóa học của hợp chất 8 cũng thể hiện rõ trên phổ NMR và phổ MS. Trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR xuất hiện thêm các tín hiệu mới của proton và cacbon của mảng kết hợp 2-methyl-5-nitrophenyl đó là sự xuất hiện thêm tín hiệu của 3 proton hệ ABX ở vùng thơm và tín hiệu nhóm methyl singlet ở vùng aliphatic. Ngoài ra, phổ khối lượng cho số khối của pic ion phân tử tại m/z 307 [M]+ phù hợp với cấu trúc của 8.
Hình 4.7 :Phổ 1H-NMR của hợp chất 8
4.2.2. Tổng hợp 6-Methyl-N-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-yl)benzene-1,3-diamine (9)
Hợp chất pyridinpyrimidine amine 9 thu được qua phản ứng khử nhóm nitro của hợp chất nitrophenylpyridinpyrimidin 8.
Cơ chế của phản ứng khử hóa nhóm nitro về amin sử dụng hydrazine xảy ra qua các bước: sự tấn công ái nhân của hydrazine lên nguyên tử N của nhóm nitro tạo thành 1-hydroxy-1-aryltriazane1-oxide, tiếp theo sự tấn công của anion HO-vào hợp chất triazane oxide này hình thành hợp chất trung gian nitroso, giải phóng diazene và H2O. Phân tử hydrazine thứ hai tấn công vào chất trung gian nitroso cho ta 1-hydroxy-1-aryltriazane và chuyển sang dạng aniline, giải phóng N2 và H2O [28]
Cấu trúc hóa học của pyridinpyrimidine amine 9 được khẳng định bằng các phương pháp phổ. Theo đó, phổ 1H-NMR 9 được đo trongDMSO-d6 xuất hiện thêm tín hiệu của 2 proton amine dưới dạng một singlet tù ở δH 4,90, phù hợp với sự có mặt của nhóm NH2. Tín hiệu singlet của 3 proton của CH3-Ph ở δH 2,08, ở trường thấp hơn là các tín hiệu của 3 proton thơm H-Ph ở δH 6,36, (dd), δH 6,83(d) và δH 6,88(d). Ở trường thấp hơn nữa là 6 tín hiệu của 6 proton mảng pyridinpirimidine từ 6,83-9,26 ppm. Phổ 13C-NMR cho tín hiệu của nhóm methyl ở δc 17,23 và 15 cacbon ở vùng trường thơm của nhân phenyl và pyridinpirimidine phù hợp với số cacbon trong phân tử. Đồng thời phổ khối lượng (ESI negative) của 9 cho pic ion
giả phân tử tại m/z 276 [M-H]- phù hợp cấu trúc phân tử dự kiến.
Hình 4.10: Phổ IR của chất 9
4.2.3. Tổng hợp 4-(Chloromethyl)-N-(4-methyl-3-(4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)phenylbenzamide (12) ylamino)phenylbenzamide (12)
Hợp chất pyridinpyrimidinphenylbenzamide methyl chloride 12 thu được qua phản ứng kết hợp của amine 9 với tác nhân chloride acid a.
Phản ứng xảy ra theo cơ chế cơ chế cộng loại nucleophin: đôi điện tử tự do của Nitơ tấn cơng ái nhân vào cacbon dương điện của nhóm chloride acid (COCl) đồng thời loại ra 1 phân tử axit HCl. HCl sinh ra được trung hịa bởi bazơ có mặt trong phản ứng như triethylamine hay các base bất kỳ nào khác. Tuy nhiên để tránh phản ứng đề HCl của nhóm ankylchloride phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ thấp 0oC và sử dụng xúc tác êm dịu là TEA.
Hình 4.11: Cơ chế cộng loại nucleophile của phản ứng tạo 12
Cấu trúc hóa học của pyridinpyrimidine amine 12 được khẳng định bằng các phương pháp phổ. Phổ 1H-NMR của 5 đã cho thấy sự xuất hiện thêm các tín hiệu
của 4 proton thơm hệ A2B2 tại δH 7,95 (d, J = 8,0 Hz, 2H) và 7,58 (d, J = 8,0 Hz,
2H) và tín hiệu của nhóm methylene tại δH 4,84 (s, 2H) của mảng benzyl kết hợp ngồi 15 tín hiệu proton của mảng phenylpyridinpirimidine. Phổ 13C-NMR cho tín hiệu của nhóm methyl ở δc 17,62, nhóm methylene ở δc 45,43 và 21 cacbon của hệ thơm và cacbon amide phù hợp số cacbon trong phân tử. Đồng thời phổ khối lượng (ESI negative) của 12 cho pic ion giả phân tử tại m/z 428 [M-H]- phù hợp cấu trúc phân tử dự đốn.
Hình 4.12: Phổ 13C của hợp chất 12
4.3. Quy trình amine hóa điều chế imatinib base (2)
Phản ứng của ankyl halide 12 với methylpiperazine xảy ra theo cơ chế thế
nucleophile lưỡng phân tử, phân tử methylpiperazine thế nguyên thử clo của ankylchloride 12. Do độ âm điện cao của nguyên tử clo làm nguyên tử cacbon của nhóm methylen dương điện. Đôi điện tử tự do của nguyên tử nitơ trong phân tử methylpiperazine tấn công ái nhân vào cacbon dương điện của nhóm methylene
Axit HCl giải phóng ra trong phản ứng được trung hòa bởi chính tác nhân methylpiperazine vì thế phản ứng thường được tiến hành với lượng dư của tác nhân methyl piperazine.
Cấu trúc hóa học của imatinib base (2) được khẳng định bằng các phương pháp phổ. Phổ 1H NMR của 2 xuất hiện thêm các tín hiệu mới của nhóm N-methyl tại δH
2,14 (s, 3H) và 8 proton của vòng piperazine tại δH 2,28 - 2,45 so với hợp chất 12. Các tín hiệu proton thơm của 3 mảng pyridinpirimidine, methylphenyl và benzylamide của chất 2 ít thay đổi. Phổ 13C-NMR cho 5 tín hiệu mới của 5 cacbon mảng methylpiperazine ở δc 45, δc 68, δc 52,53, δc 54,66. Tổng số tín hiệu cacbon phù hợp với số cacbon trong phân tử. Phổ khối tử ESI-MS của 2cho pic ion giả phân tử tại
m/z 494[M+H]+ phù hợp với cấu trúc phân tử đề nghị.
Hình 4.16: Phổ MS của chất 2
4.4. Quy trình tạo muối imatinib mesylate (3)
Phản ứng tạo muối imatinib mesylate được tiến hành trong dung môi EtOH nhằm tránh độc hại cho người lao động cũng như tồn dư của dung môi trong sản phẩm.
Cấu trúc hóa học của imatinib mesylate (3) được khẳng định bằng các phương pháp phổ. Phổ 1H NMR của 3 xuất hiện thêm các tín hiệu mới của nhóm
Phổ khối tử ESI-MS của 3 cho pic ion giả phân tử tại 590 [M+H]+, 612 [M+Na]+ phù hợp với cấu trúc phân tử đề nghị.
Hình 4.17: Phổ MS của chất 3
4.5. Việc tinh chế imatinib base
Độ tinh khiết của sản phẩm muối imatinib mesylate phụ thuộc vào độ tinh khiết của chất đầu imatinib base. Vì vậy để thu được mesylate có độ tinh khiết cao thì việc tinh chế imatinib base giữ vai trò quyết định. Imatinib base thu được từ phản ứng đun hồi lưu của một ankyl halogene 4-(chloromethyl)-N-(4-methyl-3-(4- (pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)phenylbenzamide với methylpiperazine ở nhiệt độ cao có màu vàng nhạt được xử lý với than hoạt tính đã cho sản phẩm màu trắng hơn. Nhiều phương pháp tinh chế imatinib base đã được công bố dưới dạng patent sử dụng một số dung môi và tác nhân độc hại khác như toluene, dichloromethane, pyridin, và NH3 [6-8]. Chúng tôi đã nghiên cứu sử dụng 2 dung môi không độc hại, thông dụng, giá thành thấp, được sử dụng nhiều trong dược phẩm là etanol và isopropanol cho cả bước tinh chế chất trung gian imatinib base và điều chế muối imatinib mesylate.
4.6. Hàm lƣợng imatinib mesylate theo kết quả HPLC
Dung dịch thử (chế phẩm) cho sắc ký đồ HPLC như trong hình 4.18
Hình 4.18: Sắc ký đồ HPLC của imatinib mesylate
Trên sắc ký đồ HPLC của mẫu thử ta thấy sản phẩm imatinib mesylate được điều chế có hàm lượng rất cao. Hàm lượng (%) của imatinib mesylate, tính theo chế phẩm khan, được tính theo cơng thức:
X(%) = ) 100 ( 100 100 100 a m S C S t c t Trong đó:
St: Diện tích píc imatinib mesylate trên sắc đồ dung dịch thử Sc: Diện tích píc imatinib mesylate trên sắc đồ dung dịch chuẩn C: Nồng độ imatinib mesylate trong dung dịch chuẩn (mg/ml) mt: Lượng cân mẫu thử (mg)
a: Hàm lượng nước trong mẫu thử (%)
Phép đo được tiến hành 3 lần cho kết quả như trong bảng 20