Các phương pháp sắc ký: sắc ký là một phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Sự tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào 2 pha (không trộn lẫn) luôn luôn tiếp xúc nhưng không trộn lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động.
Quá trình sắc ký gồm 3 giai đoạn chính: + Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh.
+ Cho pha động chạy qua pha tĩnh. + Phát hiện các chất.
Phương pháp phân tích sắc ký có thể được phân loại thành 2 loại chính, bao gồm: - Sắc ký lỏng: lỏng - lỏng, lỏng - rắn.
- Sắc ký khí: khí - lỏng, khí - rắn.
Phương pháp sắc ký hay được dùng phổ biến trong phân lập hợp chất hữu cơ là sắc ký lỏng - rắn: sắc ký bản mỏng và sắc ký cột.
a. Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC)
Sắc ký lớp mỏng là phương pháp nghiên cứu hiệu quả để phân tích và xác định số lượng các chất khác nhau có trong đối tượng nghiên cứu. Dựa trên nguyên tắc các chất khác nhau có độ phân cực khác nhau nên tách ra ở những vị trí khác nhau. Đây là phương pháp phân tích vi lượng, hiệu quả tách cao và thời gian thực hiện ngắn.
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel Merck 60 F254, dày 0,25mm, sử dụng các dung mơi có độ phân cực khác nhau để khảo sát và chọn ra một hệ tách tốt nhất dùng cho sắc ký cột.
Các vệt chất được phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại (λ = 254 nm và λ = 366 nm) và dung dịch thuốc thử Ce(SO4)2, tiếp theo là hơ nóng ở nhiệt độ cao.
Đối với sắc ký bản mỏng, việc lựa chọn dung môi hay hệ dung môi cho độ phân tách tốt là quan trọng nhất. Cụ thể với các yêu cầu khảo sát thì chọn dung mơi sao cho các vệt tròn, sắc nét, rải đều trên tồn bản mỏng và có Rf càng xa nhau càng tốt.
Bình triển khai : là bình thủy tinh có nắp đậy kín, có thể sử dụng các loại bình triển khai có kích thước khác nhau phù hợp với kích thước bản mỏng chạy sắc ký. Dưới đây là hình ảnh bình chạy sắc ký bản mỏng
b. Sắc ký cột
Sau khi khảo sát sắc ký bản mỏng, tiến hành sắc ký cột để tinh chế mẫu nghiên cứu. Sắc ký cột là phương pháp thường được sử dụng để phân tách các chất tuỳ theo các tính chất hóa lý của chúng. Có 3 phương pháp sắc ký cột thơng thường:
- Column Chrotomatography (CC): sắc ký cột thường. - Flash Chrotomatography (FC): sắc ký cột nhanh.
- Medium Pressure Liquid Chrotomatography (MPLC): sắc ký lỏng trung áp.
2.1.3. Phƣơng pháp pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ a. Phổ hồng ngoại (Infrared - IR) a. Phổ hồng ngoại (Infrared - IR)
Các nhóm chức trong các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong các vùng từ 10000 đến 100 cm-1 (1-100µm) và biến thành dao động của phân tử.
Sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại có định lượng nhưng phổ hồng ngoại không biểu hiện thành các đường thẳng mà là các dải hấp thụ với cường độ khác nhau bởi vì sự biến đổi năng lượng dao động luôn đi kèm với sự biến đổi năng lượng dao động quay.
Phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ 2 dạng năng lượng đó là năng lượng dao động và năng lượng quay.
Tần số hay độ dài sóng hấp thụ của mỗi chất phụ thuộc vào khối lượng tương đối của các nguyên tử, hằng số lực các dãy nối và cấu trúc hình học của nguyên tử.
Như vậy, phổ hồng ngoại cho phép nhận biết sự có mặt của các nhóm chức có trong phân tử hợp chất nghiên cứu, dựa vào cực đại hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức đó.
Phổ hồng ngoại được ghi trên máy đo hồng ngoại biến đổi Fourier hiệu FTIR Impact - 410 bằng phương pháp nén KBr.
b. Phổ tử ngoại (UV-VIS)
Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại và khả kiến phụ thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử. Sự hấp thụ ấy gây ra sự chuyển dịch các điện tử từ obitan ở trạng thái
cơ bản lên obitan có năng lượng cao hơn ở trạng thái kích thích. Chỉ có một số dạng cấu trúc trong hợp chất hữu cơ mới có sự hấp thụ ấy nên trên thực tế phổ tử ngoại cũng chỉ giới hạn trong một số hợp chất, chủ yếu là các chất có cấu trúc liên kết π liên hợp. Đặc điểm của phổ tử ngoại là phổ của một chất phức tạp có thể giống với phổ của một chất đơn giản nếu 2 chất ấy cùng chứa một nhóm cấu trúc giống nhau.
c. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance, viết tắt là NMR) là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợp chất hố học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi được đặt trong một từ một phân tử là độ chuyển dịch hoá học δ và hằng số tương tác spin – spin J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM 500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam với TMS (Tetrametylsilan) là chất chuẩn nội.
d. Phổ khối lƣợng (Mass spectrometry- MS)
Phổ khối lượng là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử [M]+, [M+H]+, [M-H]- ..., từ đó giúp ta xây dựng công thức phân tử.
Phổ khối lượng được đo bằng phương pháp ESI trên máy Agilent 1120 tại Viện Hố học, Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Dựa trên phương pháp của Wang và cộng sự, những nội dung chính thực hiện đề tài bao gồm:
- Nghiên cứu tổng hợp nguyên liệu đầu: 3-(dimethylamino)-1-(pyridin-3-yl)prop-2- en-1-one ; 4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine.
- Nghiên cứu tổng hợp các hợp chất trung gian : N-(2-methyl-5-nitrophenyl)-4-(pyridin- 3-yl)-2-amine; 6-Methyl-N-(4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-yl)benzene-1,3-diamine; 4-(Chloromethyl)-N-(4-methyl-3-(4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)phenyl)benzamide.
- Nghiên cứu qui trình tổng hợp imatinib base.
- Nghiên cứu quy trình tổng hợp imatinib mesylate từ imatinib base.
- Xác định cấu trúc các hợp chất đã tổng hợp bằng phương pháp phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng hạt nhân, và phổ khối lượng.
- Xác định hàm lượng imatinib mesylate của sản phẩm cuối bằng phương pháp HPLC.