Cấu trúc hóa học của sản phẩm đóng vịng dị tố pyridinepyrimidine amine 21 được thể trên các tín hiệu phổ NMR và phổ khối ESI-MS (Hình 12, Hình 13, Hình 14) và các số liệu phổ tại phần thực nghiệm. Trên phổ 1H-NMR của 21 cho 6 tín hiệu proton thơm của vòng pyridine và vòng pyrimidine ở δ 9,16(d, 1H), δ 8,67(dd, 1H), δ 8,37(d, 1H), từ 8,36-8,33 ppm (m, 1H) , δ 7,49(dd, 1H), và ở δ7,08(d, 1H) ngồi ra cịn tín hiệu tù của nhóm amine ở 3,83 ppm. Phổ 13C-NMR của chất 21 cũng chỉ ra 9 tín hiệu của 9 cacbon của 2 vịng pyridine và vịng pyrimidine. So sánh tín hiệu phổ NMR của 7 với 21 cho thấy, tín hiệu của nhóm ketone và 2 nhóm N-methyl đã được thay thế bởi tín hiệu của 2 cacbon sp2 tại δC 163,0 và 162,9. Các tín hiệu này hồn tồn phù hợp với sự hình thành vịng pyrimidine. Điều này đã được khẳng định bằng phổ khối lượng ESI-MS của 21 với pic ion phân tử proton hóa tại m/z 173 [M+H]+.
Hình 4.5: Phổ 1H-NMR của hợp chất 21
4.2. Quy trình tổng hợp các sản phẩm trung gian
4.2.1. Hợp chất N-(2-methyl-5-nitrophenyl)-4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine (8)
Phản ứng N-aryl hóa của pyridinepyrimidine amine 21 với 2-bromo-1-
methyl-4-nitrobenzene 23 tạo thành hợp chất trung gian chìa khóa N-(2-methyl-5-
được cải tiến thay xúc tác Pd/C bằng xúc tác CuI và sử dụng DMEDA làm phối tử với sự có mặt của basơ K2CO3 đạt được hiệu suất đến 75%.
Cơ chế của phản ứng gồm các bước: 2-bromo-1-methyl-4-nitrobenzen 23
kết hợp với CuI tạo ra phức của đồng 23a nhờ phản ứng cộng oxi hóa. Phức 3a tách khử để tạo ra hợp chất 23b và CuBr. Hợp chất 23b và 21 cộng hợp để tạo ra hợp
chất 8, đồng thời hoàn nguyên lại xúc tác CuI.
Hình 4.6: Cơ chế của phản ứng tổng hợp hợp chất 8 phản ứng “Ullmann-type”
Cấu trúc hóa học của hợp chất 8 cũng thể hiện rõ trên phổ NMR và phổ MS. Trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR xuất hiện thêm các tín hiệu mới của proton và cacbon của mảng kết hợp 2-methyl-5-nitrophenyl đó là sự xuất hiện thêm tín hiệu của 3 proton hệ ABX ở vùng thơm và tín hiệu nhóm methyl singlet ở vùng aliphatic. Ngoài ra, phổ khối lượng cho số khối của pic ion phân tử tại m/z 307 [M]+ phù hợp với cấu trúc của 8.
Hình 4.7 :Phổ 1H-NMR của hợp chất 8
4.2.2. Tổng hợp 6-Methyl-N-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-yl)benzene-1,3-diamine (9)
Hợp chất pyridinpyrimidine amine 9 thu được qua phản ứng khử nhóm nitro của hợp chất nitrophenylpyridinpyrimidin 8.
Cơ chế của phản ứng khử hóa nhóm nitro về amin sử dụng hydrazine xảy ra qua các bước: sự tấn công ái nhân của hydrazine lên nguyên tử N của nhóm nitro tạo thành 1-hydroxy-1-aryltriazane1-oxide, tiếp theo sự tấn công của anion HO-vào hợp chất triazane oxide này hình thành hợp chất trung gian nitroso, giải phóng diazene và H2O. Phân tử hydrazine thứ hai tấn công vào chất trung gian nitroso cho ta 1-hydroxy-1-aryltriazane và chuyển sang dạng aniline, giải phóng N2 và H2O [28]
Cấu trúc hóa học của pyridinpyrimidine amine 9 được khẳng định bằng các phương pháp phổ. Theo đó, phổ 1H-NMR 9 được đo trongDMSO-d6 xuất hiện thêm tín hiệu của 2 proton amine dưới dạng một singlet tù ở δH 4,90, phù hợp với sự có mặt của nhóm NH2. Tín hiệu singlet của 3 proton của CH3-Ph ở δH 2,08, ở trường thấp hơn là các tín hiệu của 3 proton thơm H-Ph ở δH 6,36, (dd), δH 6,83(d) và δH 6,88(d). Ở trường thấp hơn nữa là 6 tín hiệu của 6 proton mảng pyridinpirimidine từ 6,83-9,26 ppm. Phổ 13C-NMR cho tín hiệu của nhóm methyl ở δc 17,23 và 15 cacbon ở vùng trường thơm của nhân phenyl và pyridinpirimidine phù hợp với số cacbon trong phân tử. Đồng thời phổ khối lượng (ESI negative) của 9 cho pic ion
giả phân tử tại m/z 276 [M-H]- phù hợp cấu trúc phân tử dự kiến.
Hình 4.10: Phổ IR của chất 9
4.2.3. Tổng hợp 4-(Chloromethyl)-N-(4-methyl-3-(4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)phenylbenzamide (12) ylamino)phenylbenzamide (12)
Hợp chất pyridinpyrimidinphenylbenzamide methyl chloride 12 thu được qua phản ứng kết hợp của amine 9 với tác nhân chloride acid a.
Phản ứng xảy ra theo cơ chế cơ chế cộng loại nucleophin: đôi điện tử tự do của Nitơ tấn cơng ái nhân vào cacbon dương điện của nhóm chloride acid (COCl) đồng thời loại ra 1 phân tử axit HCl. HCl sinh ra được trung hịa bởi bazơ có mặt trong phản ứng như triethylamine hay các base bất kỳ nào khác. Tuy nhiên để tránh phản ứng đề HCl của nhóm ankylchloride phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ thấp 0oC và sử dụng xúc tác êm dịu là TEA.
Hình 4.11: Cơ chế cộng loại nucleophile của phản ứng tạo 12
Cấu trúc hóa học của pyridinpyrimidine amine 12 được khẳng định bằng các phương pháp phổ. Phổ 1H-NMR của 5 đã cho thấy sự xuất hiện thêm các tín hiệu
của 4 proton thơm hệ A2B2 tại δH 7,95 (d, J = 8,0 Hz, 2H) và 7,58 (d, J = 8,0 Hz,
2H) và tín hiệu của nhóm methylene tại δH 4,84 (s, 2H) của mảng benzyl kết hợp ngồi 15 tín hiệu proton của mảng phenylpyridinpirimidine. Phổ 13C-NMR cho tín hiệu của nhóm methyl ở δc 17,62, nhóm methylene ở δc 45,43 và 21 cacbon của hệ thơm và cacbon amide phù hợp số cacbon trong phân tử. Đồng thời phổ khối lượng (ESI negative) của 12 cho pic ion giả phân tử tại m/z 428 [M-H]- phù hợp cấu trúc phân tử dự đốn.
Hình 4.12: Phổ 13C của hợp chất 12
4.3. Quy trình amine hóa điều chế imatinib base (2)
Phản ứng của ankyl halide 12 với methylpiperazine xảy ra theo cơ chế thế
nucleophile lưỡng phân tử, phân tử methylpiperazine thế nguyên thử clo của ankylchloride 12. Do độ âm điện cao của nguyên tử clo làm nguyên tử cacbon của nhóm methylen dương điện. Đôi điện tử tự do của nguyên tử nitơ trong phân tử methylpiperazine tấn công ái nhân vào cacbon dương điện của nhóm methylene
Axit HCl giải phóng ra trong phản ứng được trung hòa bởi chính tác nhân methylpiperazine vì thế phản ứng thường được tiến hành với lượng dư của tác nhân methyl piperazine.
Cấu trúc hóa học của imatinib base (2) được khẳng định bằng các phương pháp phổ. Phổ 1H NMR của 2 xuất hiện thêm các tín hiệu mới của nhóm N-methyl tại δH
2,14 (s, 3H) và 8 proton của vòng piperazine tại δH 2,28 - 2,45 so với hợp chất 12. Các tín hiệu proton thơm của 3 mảng pyridinpirimidine, methylphenyl và benzylamide của chất 2 ít thay đổi. Phổ 13C-NMR cho 5 tín hiệu mới của 5 cacbon mảng methylpiperazine ở δc 45, δc 68, δc 52,53, δc 54,66. Tổng số tín hiệu cacbon phù hợp với số cacbon trong phân tử. Phổ khối tử ESI-MS của 2cho pic ion giả phân tử tại
m/z 494[M+H]+ phù hợp với cấu trúc phân tử đề nghị.
Hình 4.16: Phổ MS của chất 2
4.4. Quy trình tạo muối imatinib mesylate (3)
Phản ứng tạo muối imatinib mesylate được tiến hành trong dung môi EtOH nhằm tránh độc hại cho người lao động cũng như tồn dư của dung môi trong sản phẩm.
Cấu trúc hóa học của imatinib mesylate (3) được khẳng định bằng các phương pháp phổ. Phổ 1H NMR của 3 xuất hiện thêm các tín hiệu mới của nhóm
Phổ khối tử ESI-MS của 3 cho pic ion giả phân tử tại 590 [M+H]+, 612 [M+Na]+ phù hợp với cấu trúc phân tử đề nghị.
Hình 4.17: Phổ MS của chất 3
4.5. Việc tinh chế imatinib base
Độ tinh khiết của sản phẩm muối imatinib mesylate phụ thuộc vào độ tinh khiết của chất đầu imatinib base. Vì vậy để thu được mesylate có độ tinh khiết cao thì việc tinh chế imatinib base giữ vai trò quyết định. Imatinib base thu được từ phản ứng đun hồi lưu của một ankyl halogene 4-(chloromethyl)-N-(4-methyl-3-(4- (pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)phenylbenzamide với methylpiperazine ở nhiệt độ cao có màu vàng nhạt được xử lý với than hoạt tính đã cho sản phẩm màu trắng hơn. Nhiều phương pháp tinh chế imatinib base đã được công bố dưới dạng patent sử dụng một số dung môi và tác nhân độc hại khác như toluene, dichloromethane, pyridin, và NH3 [6-8]. Chúng tôi đã nghiên cứu sử dụng 2 dung môi không độc hại, thông dụng, giá thành thấp, được sử dụng nhiều trong dược phẩm là etanol và isopropanol cho cả bước tinh chế chất trung gian imatinib base và điều chế muối imatinib mesylate.
4.6. Hàm lƣợng imatinib mesylate theo kết quả HPLC
Dung dịch thử (chế phẩm) cho sắc ký đồ HPLC như trong hình 4.18
Hình 4.18: Sắc ký đồ HPLC của imatinib mesylate
Trên sắc ký đồ HPLC của mẫu thử ta thấy sản phẩm imatinib mesylate được điều chế có hàm lượng rất cao. Hàm lượng (%) của imatinib mesylate, tính theo chế phẩm khan, được tính theo cơng thức:
X(%) = ) 100 ( 100 100 100 a m S C S t c t Trong đó:
St: Diện tích píc imatinib mesylate trên sắc đồ dung dịch thử Sc: Diện tích píc imatinib mesylate trên sắc đồ dung dịch chuẩn C: Nồng độ imatinib mesylate trong dung dịch chuẩn (mg/ml) mt: Lượng cân mẫu thử (mg)
a: Hàm lượng nước trong mẫu thử (%)
Phép đo được tiến hành 3 lần cho kết quả như trong bảng 20
Mc (mg) Sc Mt (mg) St X (%) 14,01 38207,9 71,8 39199,2 99,98 14,01 38207,9 71,9 38815,1 98,87 14,01 38207,9 72,4 39188,0 99,13 TB (%) 99,33 RSD (%) 0,59
Như vậy hàm lượng của imatinib mesylate so với chất chuẩn là 99,33% .
KẾT LUẬN
Đã hoàn thành các mục tiêu của luận văn là:
1. Nghiên cứu tổng hợp các nguyên liệu đầu: Đã tiến hành phản ứng formyl hóa acetylpyridin sử dụng tác nhân N,N-dimetylformamide diethylacetal là các tác nhân sẵn có thương mại để thu được hợp chất enaminone 3-(dimethylamino)1-(pyridine- 3-yl)-prop-2-ene-1-one (7)với hiệu suấtcao (90%). Hợp chất enaminone 7đã được
ngưng tụ đóng vịng với guanidine nitrate trong môi trường kiềm cung cấp pyrimidinyl amine 4-(Pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine (21) với hiệu suất 85%. 2. Nghiên cứu tổng hợp các hợp chất trung gian: Đã tiến hành phản ứng “Ullmann-type” cải tiến sử dụng hệ xúc tác CuI/N,N’- dimethylethylenediamine/k2CO3 kết hợp pyrimidinyl amine 21với arylchloride 2-
bromo-1-methyl-4-nitrobenzene (23) hình thành liên kết C-N của chất trung gian N- (2-methyl-5-nitrophenyl)-4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-amine (8) ở hiệu suất 75%.
Hợp chất trung gian nitro 8 đã bị khử về diamine 6-Methyl-N-(4-(pyridin-3-yl)
pyrimidin-2-yl)benzene-1,3-diamine (9) bởi hệ khử hydrazine hydrate /FeCl3/C trong methanol với hiệu suất 89%. Phản ứng acyl hóa của diamine 9 với benzoyl
chloride 4-(chloromethyl)benzoyl chloride (a) đã cung cấp benzyl chloride 4- (chloromethyl)-N-(4-methyl-3-(4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)phenyl)benzamide (12) ở hiệu suất 87%.
3. Nghiên cứu phản ứng điều chế imatinib base N-(4-Methyl-3-(4-(pyridin-3-
yl)pyrimidin-2-ylamino)phenyl)-4-((4-methylpiperazin-1-yl)methyl)benzamide(2). Phản ứng amine hóa benzyl chlorua 12 được tiến hành trong sự dư thừa của amine 1-methylpiperazine với tỉ lệ Benzyl chloride 12: amine (1/5, mol/mol) đã giảm đáng kể lượng amine dư thừa theo quy trình đã được công bố (tỉ lệ Benzyl chloride 12: amine (1/10, mol/mol) với hiệu suất cao 85%.
4. Nghiên cứu phản ứng tạo muối imatinib mesylate N-(4-Methyl-3-(4-(pyridin- 3-yl)pyrimidin-2-ylamino)phenyl)-4-((4-methylpiperazin-1-
yl)methyl)benzamidemethanesulfonate(3)từ imatinib base 2 và phương pháp tinh
chế để thu được sản phẩm imatinib mesylate 3 có hàm lượng cao theo HPLC.
5. Xác định cấu trúc các sản phẩm trung gian và sản phẩm cuối bằng các phương pháp phổ Hồng ngoại (FT-IR), phổ Cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều ( 1
H, 13 C-NMR), 2 chiều (HMBC, HSQC)và phổ Khối (ESI- MS).
6. Xác định hàm lượng của imatinib tổng hợp bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC đạt 99,33%.
7. Lần đầu tiên ở Việt Nam đã nghiên cứu thành cơng tổng hợp tồn phần hợp chất imatinib mesylate và phương pháp tinh chế để thu được sản phẩm imatinib mesylate tinh khiết đạt đến 99,33% theo HPLC. Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa định hướng cho việc triển khai tổng hợp sản phẩm imtinib mesylate ở qui mô pilot tiến tới sản suất sản phẩm này ở nước ta.
CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
Nguyễn Quốc Vượng*, Vũ Văn Chiến, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thị Huế, Phạm Văn Cường, “Nghiên cứu tổng hợp imatinib base”, Tạp chí Hóa học
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Mã Lương Minh (2006), Chuẩn đốn phịng trị bệnh ung thư máu, Nxb. Tổng hợp thành phố Hồ Chí Minh.
Tài liệu tiếng Anh
2. Castaner J. and et all., Drugs Fut.(2001),6, 1765-174.
3. Christian Wolf, Shuanglong Liu, Xuefeng Mei, Adam T. August, and Michael D. Casimir, J. Org. Chem., (2006), 71, 3270-3273.
4. Dawei Ma and Qian Cai, Organic Letters, (2003), 5(21), 3799-3802. 5. Driver M. S., Hartwig J. F., J. Am. Chem. Soc.(1997), 119, 8232.
6. Druker B. J., Moshe Talpaz., Debra J. Resta, Bin Peng, Buchdunger E., John M. Ford, Nicholas B. Lydon, Hagop Kantarjian, Renaud Capdeville, Sayuri Ohno- Jones, Charles L. Sawyers., N. Engl. J. Med., (2001), Vol. 344(14) 1031-1037.
7. Elena Diez-Cecilia, Brendan Kelly, Isabel Rozas One-step double reduction of aryl nitro and carbonyl groups using hydrazine, Tetrahedron Letters 52 (2011) 6702–6704
8. Gao H., Lee B-N., Talpaz M., Donato N. J., Cortes J. E., Katarjian H. M., Reuben J. M., Leukemia(2005), 19, 1905-1911
9. Hartwig J. F., Pure Appl. Chem.(1999), 71, 1417.
10. Henkermeyer M. J., Bennett R. L., Gertler F. B., Hoffmann F. M., Molecular and Cellular Biology, (1988), Vol. 8(2), 843-853.
11. Huang Anli, Liu Xing, Lior Zelikovitch, Joseph Kaspi U.S. Patent 7,507,821B2 (2006). 12. Krystal G. W., Honsawek S., Litz J., Buchdunger E., Clin. Cancer Res. (2000), 6, 3319. 13. Li J. J., Johnson D. S., Slisskovic D. R., Roth B. D., Contemporary Drug Synthesis. Copyright© (2004) John Wiley &Sons, Inc. , page 29-37.
14. Lindley J., Tetrahedrone(1984), 40, 1433.
15. Liu Xing , He Xungui, Yuan Wang, Michel Bekhazi, Sonia Krivonos, Edna Danon, U.S. Patent 7,550,591B2 (2008).
16. Liu Y. F., Wang C. L., Bai Y. J., Han Ning, Jiao J. P., and Qi X. L., Orgnic
Process Research & Development (2008), 12, 490-495.
17. Loiseleur O., Kufmann D., Abel S., Buerger H. M., Meisenbach M., Schmitz B., Sedelmer G., W. O. Patent 03/066,613 (2003).
18. Loiseleur O., Kufmann D., Abel S., Buerger H. M., Meisenbach M., Schmitz B., Sedelmer G., U.S. Patent 7,825,247B2 (2007).
19. Lowe W., Braun B., Muller B., J. Heterocycl. Chem. (1994), 31, 1577. 20. Lyseng-Wilhamson K., Jarvis B. Drugs (2001), 61, 303-315.
21. Michael Samoszuk and Mark A. Corwin, Int. J. Cancer,(2003), 106, 647-652. 22. Schuda P. F., Ebner C. B., Morgan T. M., Tetrahedrone Lett.(1986), 27, 2567 23. Selic L., Gradadolnik S. G., Stanovnik B., Helv. Chim. Acta, (1997) 80, 2418. 24. Wojciech Szczepek, Wojciech Luniewski, Lukasz Kaczmarek, Bogdan
Zagrodzki, Dorota Samson-Lazinska, Wieslaw Szelejewski, Maciej Skarzynski U.S.
25. Zimmermann J., U.S. Patent 5,521,184 (1996).
26. Zimmermann J., Buchdunger E.,Mett H., Meyer T., Lydon N. B., Traxler P.,
Bioorg. Med. Chem. Lett.(1996), 11, 1221.
27. Zimmermann J., Buchdunger E.,Mett H., Meyer T., Lydon N. B., Bioorg. Med.
Chem. Lett.(1997), 7(2), 187-192.
28. Zimmermann J. and et all., Med. Res. Rev. (2001), 21, 499-512.
Trang web: 29.http://vi.wikipedia.org/wiki/Ung_th%C6%B0_b%E1%BA%A1ch_c%E1%BA% A7u 30. http://www.dieutri.vn/benhmau/25-4-2011/S141/Benh-bach-cau-tuy-xuong- man-tinh.htm#ixzz3NuAQFG4b 31. http://suckhoedoisong.vn/duoc-si-tu-van/imatinib-thuoc-nham-trung-dich- 20100111101515988.htm
Phụ lục 1: Phổ 1 H -N MR của c hất 7
Phụ lục 2: Phổ 13 C -N MR của c hất 7
Phụ lục
3: Phổ I
R của
chất
Phụ lục
4: Phổ
MS củ
a chất
Phụ lục 5: Phổ 1 H -N MR của c hất 21
Phụ lục 6: Phổ 13 C -N MR của c hất 2 1
Phụ lục
7: Phổ I
R của
chất
Phụ lục
8: Phổ
MS củ
a chất
Phụ lục 9: Phổ 1 H -N MR của c hất 8
Phụ lục 10 : Phổ 13 C -N MR của c hất 8
Phụ lục 11 : Phổ IR củ a chất 8
Phụ lục 12 : Phổ MS c ủa chất 8
Phụ lục 1 3: Phổ 1 H -N MR của c hất 9
Phụ lục 14 : Phổ 13 C -N MR của c hất 9
Phụ lục 15 : Phổ IR củ a chất 9
Phụ lục 16 : Phổ MS c ủa chất 9
Phụ lục 1 7: Phổ 1 H -N