Plasmid, DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Kết quả real-time PCR O. tsutsugamushi Rick pOri + - pRick - + SM1604 + - SM1608 - + E.coli - - Klebsiella pneumoniae - - Proteus mirabilis - - Pseudomonas aeruginosa - - Acinetobacter baumannii - - Samonella.sp - - Neisseria meningitidis - - Staphylococcus aureus - - Streptococcus suis - -
3.1.4. Đánh giá độ nhạy của kĩ thuật Real-time PCR.
Để đánh giá độ lặp lại và ngưỡng phát hiện, các plasmid chứng dương được pha loãng đến các nồng độ 104, 103, 102, 101, 4, 2, 1 (copies/µl) và thực hiện phản ứng real-time PCR với 50 phản ứng lặp lại.
Với các nồng độ plasmid hơn kém nhau 10 lần, chúng tôi xây dựng đường chuẩn tuyến tính như sau:
pOri : Y= - 3.366 x LOG(X) + 39.38 với hiệu suất phản ứng là 98,2%; R2 = 1 pRick: Y= - 3.446 x LOG(X) + 39.34 với hiệu suất phản ứng là 95,1%; R2 = 1 Trên mỗi đường biểu diễn chuẩn, hai thông số hiệu suất phản ứng và hệ số tương quan (R2) được thể hiện có ý nghĩa đánh giá quá trình thực hiện phản ứng. Một phản ứng được chấp nhận khi giá trị hệ số tương quan R2 ≥ 0,99; và hiệu suất phản
ứng đạt được giá trị trong khoảng 90%-105%. Trong nghiên cứu của chúng tôi, giá trị hệ số tương quan R2 của cả hai phản ứng đều bằng 1, và hiệu suất phản ứng lần lượt là 98,2% và 95,1% với O. tsutsugamushi và Rickettsia.
Hình 3.9: Đường chuẩn tuyến tính, tín hiệu khuếch đại thu được của pOri
Hình 3.10: Đường chuẩn tuyến tính, tín hiệu khuếch đại thu được của pRick
Thực hiện phản ứng real-time PCR với 50 lần lặp lại ở các nồng độ, kết quả thu được như sau: Tại nồng độ plasmid 2 copies/µl, đối với pOri 41/50 (82%) lần lặp lại (hình 3.11A), với pRick 35/50 (70%) lần lặp lại (hình 3.11B) cho kết quả dương tính. Kết quả dương tính ở các lần lặp lại 100% ở nồng độ 4 copies/µl ở cả pOri và pRick.
Hình 3.11: Biểu đồ tỷ lệ dương tính với 50 phản ứng real-time PCR lặp lại
Các nồng độ: 1, 2, 4, 101, 102, 103, 104 (copies/µl) A: pOri B: pRick
Hình 3.12: Đường biểu diễn tín hiệu khuếch đại phản ứng real-time PCR.
(A) Real-time PCR pOri. (B) Real-time PCR pRick
Trong nghiên cứu của Dong-Min Kim và cộng sự, khi so sánh PCR, nested PCR giữa các cặp mồi thiết kết ở gen 56kDa và 47kDa cho thấy khơng có sự khác biệt về độ nhạy và độ đặc hiệu, trong khi đó kỹ thuật real-time PCR thiết kế trên gen
47kDa cho ngưỡng phát hiện là 50 copies/µl [27]. Nghiên cứu của chúng tơi mồi và
probe được thiết kế trên vùng gene 56kDa đối với O. tsutsugamushi xác định được độ đặc hiệu và độ nhạy lần lượt là 100% và 20 copies/phản ứng.
Theo Liang và cộng sự, kết quả đánh giá độ nhạy của phản ứng real-time PCR phát hiện SFG với vùng gen đích ompA là 200 copies trên một phản ứng [35]. Một nghiên cứu khác của Jiang chỉ ra rằng real-time PCR dựa trên vùng gen đích ompB
hạn chế phát hiện chỉ một số loài trong chi Rickettsia và độ nhạy của phản ứng
trong nghiên cứu này là 10 copies/µl [23]. Trong khi đó, nghiên cứu của chúng tơi các mồi và probe đặc hiệu đều được thiết kế trên vùng gen gltA của các loài vi
khuẩn Rickettsia cho các phản ứng nested PCR cũng như real-time PCR. Kết quả
xác định độ đặc hiệu là 100% và độ nhạy là 4 copies/µl tương ứng với 20 copies trên một phản ứng. Đã có nhiều nghiên cứu trước đây về xây dựng kĩ thuật real-time PCR phát hiện Rickettsiaceae, tuy nhiên những nghiên cứu đó chủ yếu tập trung vào một số loài cụ thể và dựa vào việc nghiên cứu loài nào để lựa chọn vùng gen phù hợp. Rickettsiaceae là lồi vi khuẩn có hệ gen dễ bị biến đổi, vì vậy nghiên cứu
nhóm vi khuẩn này cần đánh giá hệ gen theo khu vực phân bố, chúng tôi lựa chọn gen 56kDa, gltA để nghiên cứu O. tsutsugamushi và Rickettsia theo phần lớn các
báo cáo trước đây trong khu vực. Hai vùng gen này cũng đã được đánh giá có tính đặc hiệu và bảo thủ cao. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, kĩ thuật real-time PCR phát hiện O. tsutsugamushi và Rickettsia cho kết quả độ đặc hiệu và độ nhạy cao.
3.2. Ứng dụng real-time PCR phát hiện Rickettsiaceae trên các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nghi ngờ
3.2.1. Một số đặc điểm của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Rickettsiaceae
Dựa trên các tiêu chuẩn như trên phần phương pháp đã đặt ra, có 87 bệnh nhân được lựa chọn trong nghiên cứu này của chúng tôi từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 9 năm 2017. Những bệnh nhân này có các biểu hiện lâm sàng nghi ngờ do nhiễm
Rickettsiaceae hoặc sốt chưa rõ nguyên nhân. Để hiểu rõ về dịch tễ học của bệnh,
chúng tôi đánh giá tỷ lệ bệnh nhân qua một số đặc điểm như giới tính, độ tuổi.
Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi và giới tính
Trong số 87 bệnh nhân nghiên cứu, có 59 bệnh nhân là nam chiếm tỷ lệ 67,82%; 28 bệnh nhân là nữ 32,18%. Trên hình 3.13 có thể thấy sự khác biệt rõ về tỷ lệ bệnh nhân nam và nữ, cụ thể tỷ lệ bệnh nhân nam nhiều hơn bệnh nhân nữ khoảng gấp hai lần. Tuổi trung bình của bệnh nhân trong nghiên cứu là 55,29 ± 14,16. Bệnh nhân ở nhóm tuổi 17-60, chiếm tỷ lệ cao nhất 62,07%; có 1 bệnh nhân là trẻ em 8 tuổi với tỷ lệ 1,15%; nhóm bệnh nhân trên 60 tuổi chiếm tỷ lệ tương đối
cao với 36,78% (Hình 3.14). Có thể thấy đối tượng có nguy cơ nhiễm bệnh ở tất cả các nhóm tuổi từ 19 – 92 tuổi, ít gặp ở nhóm dưới độ tuổi lao động.
Hình 3.13: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân theo giới tính
Trong đó: 67,82% bệnh nhân là nam, 32,18% bệnh nhân là nữ
Hình 3.14: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân theo độ tuổi
3.2.2. Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsiaceae bằng kỹ thuật real-time PCR
Tiến hành phản ứng real-time PCR để phát hiện O. tsutsugamushi và
Rickettsia trên 87 bệnh phẩm nghi ngờ sốt do Rickettsiaceae theo qui trình như phần
phương pháp đã trình bày. Kết quả tín hiệu huỳnh quang ghi nhận được sau phản ứng real-time PCR xác định O. tsutsugamushi được thể hiện trên hình 3.15, tương
các tín hiệu dương ở các ống đối chứng dương, nội chuẩn (IC) và mẫu nghiên cứu, đồng thời khơng ghi nhận tín hiệu ở ống đối chứng âm.
Hình 3.15: Tín hiệu khuếch đại real-time PCR phát hiện O. tsutsugamushi.
Hình 3.16: Kết quả real-time PCR phát hiện O. tsutsugamushi và Rickettsia trên
bệnh phẩm nghi ngờ.
Với 87 bệnh phẩm máu và mô lấy tại vết loét, chúng tôi thu được kết quả 33,33% dương tính với 1 trong 2 mầm bệnh. Trong đó 3 mẫu dương tính với chiếm 3,45% và 26 mẫu dương tính với Rickettsia tương ứng với 29,88% (hình 3.16).
Kết quả chúng tôi cũng phù hợp với công bố của tác giả Nguyễn Vũ Trung và cộng sự, khi nghiên cứu về tỷ lệ lưu hành Rickettsiaceae trên cộng đồng bằng các
Rickettsia lớn hơn so với nhiễm O. tsutsugamushi [66]. Trong khi đó Hang LK Nguyen và cộng sự nghiên cứu trên 63 mẫu bệnh nhân nghi ngờ sốt mị (do O. tsutsugamushi) có vết lt điển hình, nhóm nghiên cứu phát hiện 42 mẫu (67%)
dương tính với O. tsutsugamushi và khơng có mẫu nào dương tính với Rickettsia
[42]. Trong nghiên cứu của chúng tơi có 03 bệnh nhân có vết lt điển hình của sốt mị do O. tsutsugamushi cả 3 mẫu máu từ các bệnh nhân này đều được khẳng định là dương tính với O. tsutsugamushi và âm tính với Rickettsia. Kết quả của chúng tơi cũng khẳng định không phát hiện Rickettsia trên các bệnh có vết loét điển hình, đồng thời cũng khơng phát hiện O. tsutsugamushi trên các mẫu khơng tìm thấy vết loét. Với 33,33% dương tính, cho thấy tỷ lệ cao đáng kể trong 87 bệnh nhân có biểu hiện sốt chưa rõ nguyên nhân với 3 trường hợp xuất hiện vết loét điển hình đều dương tính O. tsutsugamushi. Như vậy, có thể thấy Rickettsiaceae là căn nguyên gây bệnh đáng được chú ý. Từ trước đến nay, các nghiên cứu ở Việt Nam thường tập trung vào bệnh STG với vết lt điển hình mà ít quan tâm, nghiên cứu với những trường hợp sốt ko có vết loét. Bệnh do Rickettsiaceae gây ra có thể được lây truyền bởi nhiều loại vector lây nhiễm khác nhau như bọ chét, các loài bọ ve, mọt, rận, bọ phấn hay đặc biệt hơn là muỗi. Hơn nữa, những bệnh này khơng phải tất cả đều có triệu chứng vết loét, có những bệnh khơng xuất hiện vết lt gây khó khăn cho việc chẩn đốn [38]. Phân tích sâu hơn về chủng Rickettsia chúng tơi giải trình tự ngẫu nhiên 02 mẫu dương tính với Rickettsia cho thấy trình tự thu được gần nhất với chủng R. typhi.
3.2.3. Một số đặc điểm của bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae
Trong số 29 ca bệnh nhiễm O.tsutsugamushi và Rickettsia có 19 bệnh nhân là nam chiếm tỷ lệ 65,52%; 10 bệnh nhân là nữ chiếm tỷ lệ 34,48%. Độ tuổi các bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae chủ yếu từ 29-86 tuổi. Tuy nhiên có 1 bệnh nhân là trẻ em 8 tuổi chiếm tỷ lệ 3,45%. Nhóm tuổi 17-60 chiếm tỷ lệ cao nhất với 62,07%. Nhóm tuổi lớn hơn 60 tuổi cũng chiếm tỷ lệ tương đối cao là 34,48%. Qua phân tích sự phân bố tỷ lệ bệnh nhân, nhận thấy có sự tương đồng giữa nhóm bệnh nhân nghi ngờ và nhóm bệnh nhân mắc bệnh. Kết quả của chúng tôi cũng tương tự với
công bố của Phạm Thanh Thủy (2007), Suputtamongkol và cộng sự (2009) khi thấy bệnh nhân nhiễm Rickettsia gặp ở mọi lứa tuổi [1][64].
Hình 3.17: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo giới tính
Hình 3.18: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo nhóm tuổi
Về phân bố theo địa lý, người bệnh sinh sống ở 8 tỉnh thành khác nhau và có 1 bệnh nhân đến từ Lào chiếm 3,45%. Tuy nhiên, số lượng bệnh nhân chủ yếu tập trung ở Hà Nội với 62,07% (hình 3.19). Nghiên cứu của chúng tôi thực hiện tại bệnh viện Trung ương Quân đội 108 trong thành phố Hà Nội, thuận tiện trong việc thăm khám bệnh đối với những bệnh nhân thuộc Hà Nội và các khu vực lận cận.
Hình 3.19: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo địa lý
Hình 3.20: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo các tháng trong năm
Số người nhiễm Rickettsiaceae chủ yếu tập trung từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm, cao nhất vào tháng 5, tháng 7 với tỷ lệ tương ứng là 18,18% và 20,45% (hình 3.20). Mặc dù có sự sai khác với tỷ lệ nghi ngờ nhiễm bệnh, nhưng điều này cũng có thể lý giải được do đặc điểm của các lồi cơn trùng chân đốt có khả năng lây truyền bệnh thường phát triển mạnh vào các tháng có khí hậu nóng ẩm trong năm. Kết quả này cũng tương tự như tỷ lệ phân bố các ca SFG theo báo cáo của CDC Hoa Kỳ (Centers For Disease Control and Prevetion, USA) [76].
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau:
1. Xây dựng thành cơng qui trình Real-time PCR để phát hiện Orientia và
Rickettsia với:
- Cặp mồi và probe đặc hiệu cho real-time PCR:
O.tsu108S-F3 ̶ O.tsu108S-R3 ̶ O.tsu108S-Pro đối với Orientia Rick.S-CS-F1 ̶ Rick.S-CS-R1 ̶ Rick.S-CS-Pro1 đối với Rickettsia
- Độ đặc hiệu và độ nhạy của cả hai qui trình này tương ứng là 100% và 20 copies/phản ứng.
2. Áp dụng kĩ thuật phát hiện căn nguyên gây bệnh trên 87 mẫu bệnh nhân nghi ngờ có 3 trường hợp dương tính với Orientia chiếm 3,45%, 26 trường hợp
KIẾN NGHỊ
Do hạn chế về thời gian nên nghiên cứu của chúng tôi chưa được tiến hành với quy mô lớn hơn để phát hiện Rickettsiaceae. Hướng nghiên cứu tiếp theo dự
kiến của đề tài:
1. Phân tích kỹ các đặc điểm dịch tễ học của bệnh do Rickettsiaceae.
2. Giải trình tự những mẫu dương tính với O. tsutsugamushi và Rickettsia ở các vùng gen đang thực hiện và các vùng gen khác nhằm phân tích phân loại sinh học.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Phạm Thanh Thủy (2007) ―Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, phương pháp chẩn đốn và điều trị bệnh sốt mị,‖ Đại học Y Hà Nội.
Tài liệu Tiếng Anh
2. Amano K., Tamura A., Ohashi N., Urakami H., Kaya S., et al. (1987) ―Deficiency of peptidoglycan and lipopolysaccharide components in Rickettsia tsutsugamushi.,‖ Infect. Immun., vol. 55, no. 9, pp. 2290–2292. 3. Anderson B. E., Tzianabos T. (1989) ―Comparative sequence analysis of a
genus-common rickettsial antigen gene.,‖ J. Bacteriol., vol. 171, no. 9, pp.
5199–5201.
4. Andersson S. G. E., Zomorodipour A., Andersson J. O., Sicheritz-Pontén T., Alsmark U. C. M., et al. (1998) ―The genome sequence of Rickettsia prowazekii and the origin of mitochondria,‖ Nature, vol. 396, no. 6707, pp.
133–140.
5. Aung A. K., Spelman D. W., Murray R. J., Graves S. (2014) ―Rickettsial infections in Southeast Asia: implications for local populace and febrile returned travelers,‖ Am. J. Trop. Med. Hyg., vol. 91, no. 3, pp. 451–460. 6. Aydin S. (2015) ―A short history, principles, and types of ELISA, and our
laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA,‖ Peptides,
vol. 72, pp. 4–15.
7. Bechah Y., Capo C., Mege J.-L., Raoult D. (2008) ―Rickettsial diseases: from Rickettsia–arthropod relationships to pathophysiology and animal models.‖ 8. Berman S. J., Kundin W. D. (1973) ―Scrub typhus in South Vietnam: a study
of 87 cases,‖ Ann. Intern. Med., vol. 79, no. 1, pp. 26–30.
9. Bozeman F. M., Elisberg B. L. (1963) ―Serological diagnosis of scrub typhus by indirect immunofluorescence,‖ Proc. Soc. Exp. Biol. Med., vol. 112, no. 3, pp. 568–573.
vectorborne disease,‖ Clin. Infect. Dis., vol. 46, no. 6, pp. 913–918.
11. Cowan G. (2000) ―Rickettsial diseases: the typhus group of fevers—a review,‖ Postgrad. Med. J., vol. 76, no. 895, pp. 269–272.
12. Cruickshank R. (1927) ―The Weil-Felix reaction in typhus fever,‖ Epidemiol.
Infect., vol. 27, no. 1, pp. 64–69.
13. Dasch G. A., Halle S., Bourgeois A. L. (1979) ―Sensitive microplate enzyme- linked immunosorbent assay for detection of antibodies against the scrub typhus rickettsia, Rickettsia tsutsugamushi.,‖ J. Clin. Microbiol., vol. 9, no. 1, pp. 38–48.
14. Dumler J. S., Walker D. H. (2005) ―Rocky Mountain spotted fever–changing ecology and persisting virulence,‖ N Engl J Med, vol. 353, no. 6, pp. 551–
553.
15. Edwards MS F. R. (2004) ―Rickettsial diseases,‖ in Pediatric Infectious Diseases, 5th ed, pp. 2497–2515.
16. Engvall E., Perlmann P. (1971) ―Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G,‖ Immunochemistry, vol. 8, no. 9, pp. 871–874.
17. Ericsson C. D., Jensenius M., Fournier P.-E., Raoult D. (2004) ―Rickettsioses and the international traveler,‖ Clin. Infect. Dis., vol. 39, no. 10, pp. 1493–
1499.
18. Fournier P.-E., Roux V., Raoult D. (1998) ―Phylogenetic analysis of spotted fever group rickettsiae by study of the outer surface protein rOmpA,‖ Int. J. Syst. Evol. Microbiol., vol. 48, no. 3, pp. 839–849.
19. Fournier P. E., Raoult D. (2004) ―Suicide PCR on skin biopsy specimens for diagnosis of Rickettsioses,‖ J. Clin. Microbiol., vol. 42, no. 8, pp. 3428–3434. 20. Groß D., Schäfer G. (2011) ―100th Anniversary of the death of Ricketts: Howard Taylor Ricketts (1871–1910). The namesake of the Rickettsiaceae family,‖ Microbes Infect., vol. 13, no. 1, pp. 10–13.
21. Hamaguchi S., Cuong N. C., Tra D. T., Doan Y. H., Shimizu K., et al. (2015) ―Clinical and epidemiological characteristics of scrub typhus and murine
typhus among hospitalized patients with acute undifferentiated fever in northern Vietnam,‖ Am. J. Trop. Med. Hyg., vol. 92, no. 5, pp. 972–978. 22. Izzard L., Fuller A., Blacksell S. D., Paris D. H., Richards A. L., et al. (2010)
―Isolation of a novel Orientia species (O. chuto sp. nov.) from a patient infected in Dubai,‖ J. Clin. Microbiol., vol. 48, no. 12, pp. 4404–4409.
23. Jiang J. U., Temenak J. J., Richards A. L. (2003) ―Real‐Time PCR Duplex Assay for Rickettsia prowazekii and Borrelia recurrentis,‖ Ann. N. Y. Acad. Sci., vol. 990, no. 1, pp. 302–310.
24. Jr A. K. (1995) Tsutsugamushi Disease. Tokyo: University of Tokyo Press. 25. Kelly D. J., Fuerst P. A., Ching W.-M., Richards A. L. (2009) ―Scrub typhus:
the geographic distribution of phenotypic and genotypic variants of Orientia tsutsugamushi,‖ Clin. Infect. Dis., vol. 48, no. Supplement_3, pp. S203–S230. 26. Kim D.-M., Kim H. L., Park C. Y., Yang T. Y., Lee J. H., et al. (2006)
―Clinical usefulness of eschar polymerase chain reaction for the diagnosis of scrub typhus: a prospective study,‖ Clin. Infect. Dis., vol. 43, no. 10, pp.