Một phản ứng ELISA xảy ra trong đó kháng thể bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên cụ thể. Các mẫu có số lượng kháng nguyên chưa biết được cố định trên một giá thể rắn (thường là một tấm polystyrene vi chuẩn) hoặc không đặc hiệu (thông qua hấp phụ lên bề mặt) hoặc đặc hiệu (thông qua chụp bằng kháng thể khác đặc hiệu với kháng nguyên tương tự trong thí nghiệm ELISA sandwich).
Sau khi kháng nguyên được cố định, các kháng thể phát hiện được thêm vào, tạo thành một phức hợp với các kháng nguyên. Các kháng thể phát hiện có thể liên kết với một loại enzyme, hay chính nó có thể được phát hiện bởi một kháng thể thứ cấp liên kết với một loại enzyme thơng qua liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học. Các phần của kháng thể ELISA là tương tự với phương pháp western blot. Giữa mỗi bước, các đĩa thường được rửa bằng dung dịch tẩy nhẹ để loại bỏ các protein hoặc các kháng thể không gắn. Sau bước rửa cuối cùng, cơ chất của enzyme được thêm vào để tạo ra tín hiệu có thể nhìn thấy, giúp chỉ ra số lượng kháng nguyên trong mẫu [6].
Do có những ưu điểm về độ nhạy, độ đặc hiệu và khả năng sản xuất kit thương mại, ELISA được khuyến cáo sử dụng như xét nghiệm chuẩn cho chẩn đốn các lồi Rickettsiaceae ở vùng bệnh lưu hành [13]. Tuy nhiên phương pháp này còn những hạn chế trong việc chẩn đoán bệnh ở giai đoạn sớm hay trong trường hợp xuất hiện vết loét và khơng chẩn đốn được bằng huyết thanh học [33].
1.5.4. Phương pháp kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
Indirect Fluorescent Antibody (IFA) lần đầu tiên được Bozeman và cộng sự mô tả vào năm 1963 [9]. Sau đó đã được thay đổi để cho phép sử dụng lượng huyết thanh và kháng nguyên nhỏ hơn. Hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến nhằm chẩn đốn nhanh chóng bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae.
Phương pháp miễn dịch huỳnh quang có độ nhạy cao, tuy nhiên sự khác nhau giữa các lồi Rickettsiaceae khó phân biệt do có phản ứng liên kết chéo kháng thể. Một phương pháp được phát triển bởi phịng thí nghiệm tham chiếu Rickettsiaceae
của Úc đã tối ưu hoá phương pháp này, tăng giá trị ngưỡng phát hiện lên 1:128 nhằm giảm tỉ lệ dương tính giả [22]. IFA vẫn đang được xem là tiêu chuẩn vàng trong việc chẩn đoán huyết thanh học, nhưng gần đây các phương pháp chẩn đoán
phân tử đang được kiểm chứng để giúp việc chẩn đốn nhanh chóng chính xác hơn ở giai đoạn đầu của bệnh. Trong một nghiên cứu mới đây của Cherry Lim và cộng sự (2015), 24 bệnh nhân bị nhiễm sốt Dengue, được kiểm tra bằng IFA IgM-STG
cho kết quả 5 bệnh nhân dương tính. Trong khi đó với các xét nghiệm ni cấy tế bào, hay phương pháp PCR đều cho kết quả âm tính. Như vậy, điều đó chỉ ra rằng độ đặc hiệu của phương pháp IFA thấp hơn so với phương pháp PCR [36].
1.5.5. Phương pháp PCR, nested PCR
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn ADN mà khơng qua tạo dịng. Phương pháp này được Kary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988 [39]. Phương pháp PCR được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất nhiều bản sao ADN. Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phơi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,… Đây là một phương pháp tổng hợp ADN dựa trên mạch khn là một trình tự đích ADN ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn ADN này. Mồi là những đoạn ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn ADN khuôn và nhờ hoạt động của ADN polymerase đoạn mồi này được kéo dài để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của ADN polymerase, đoạn ADN nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn ADN này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự ADN xác định, cần phải có những thơng tin tối thiểu về trình tự của ADN, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn ADN đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau :
Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94 - 95oC) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử ADN mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trị là mạch khn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.
Bước 2: (bắt cặp, annealing)
Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65oC. Tùy thuộc vào Tm của các mồi mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.
Bước 3: (kéo dài, elongation – extension)
Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho ADN polymerase hoạt động tốt nhất. Dưới tác động của ADN polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự ADN khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:
Tổng lượng ADN khuếch đại = m x 2n (m: Là lượng ADN ban đầu; n: số chu kỳ). Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.
Nested PCR là một dạng thay đổi của PCR thường, trong đó hai cặp mồi PCR được dùng để khuếch đại đoạn DNA. Phản ứng nested PCR phải được thực hiện hai lần. Lần đầu, phản ứng PCR được thực hiện trong 15 đến 30 chu kỳ, với cặp mồi thứ 1, cho phép khuếch đại đoạn gen dài hơn đoạn gen cần xác định nằm trong đoạn gen được khuếch đại lần 1. Sản phẩm PCR lần 1 sau đó sẽ là mẫu cho PCR lần 2, cặp mồi thứ 2 sẽ bắt cặp phía trong của sản phẩm PCR lần 1 và khuếch đại đoạn gen cần xác định.
Ưu điểm của nested PCR là tăng độ đặc hiệu vì phản ứng PCR lần 2 chỉ xảy ra dựa trên sản phẩm của PCR lần 1. Đồng thời phương pháp này tăng độ nhạy vì tổng số chu kỳ nhân lên nhiều hơn. Tuy nhiên hạn chế của phương pháp này dễ lây nhiễm do phải chuyển mẫu giữa hai lần thực hiện phản ứng.
Năm 2006, ở Hàn Quốc, một báo cáo của Kim và cộng sự bằng phản ứng PCR mẫu vết loét cho thấy ADN O. tsutsugamushi đã được phát hiện trong 6 trên 7 bệnh
nhân có xuất hiện vết loét mà âm tính với IFA [26]. Trong một nghiên cứu khác ở Thái Lan, kết quả chỉ ra 3 trong số 20 (15%) bệnh nhân có biểu hiện sốt là dương tính khi thực hiện phản ứng PCR, mặc dù có kết quả huyết thanh học âm tính [60]. Như vậy kĩ thuật phân tử là phương pháp cần thiết giúp cho việc chẩn đốn ngày càng chính xác hơn. Một nghiên cứu khác năm 2011 của Prakash và cộng sự đã sử dụng nested PCR trên vùng gen 56kDa để phát hiện O. tsutsugamushi, kết quả cho
thấy độ đặc hiệu của kĩ thuật này là 100% cao hơn so với hai phương pháp ELISA và Weil-Felix với độ đặc hiệu lần lượt là 73% và 94% [51].
1.5.6. Phương pháp real-time PCR
Real-time PCR là kỹ thuật nhân bản ADN đích trong ống nghiệm lên hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại đích thể hiện ngay sau mỗi chu kỳ của phản ứng bằng cách thu nhận các tín hiệu huỳnh quang. Trong q trình xảy ra phản ứng, có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu xuất hiện trong ống PCR thì taqman probe đặc hiệu với trình tự đích sẽ bắt cặp vào sản phẩm khuếch đại và sẽ bị phân giải bởi enzyme taqpolymerase (nhờ hoạt tính 5‘-3‘ exonuclease) khi tổng hợp sợi bổ sung ở giai đoạn kéo dài. Sự phân giải taqman probe sẽ làm tách rời chất phát huỳnh quang (fluorophore) FAM ở đầu 5‘ khỏi chất hấp phụ huỳnh quang (quencher) ở đầu 3‘của probe, nhờ vậy ống phản ứng sẽ phát huỳnh quang khi bị chiếu tia cực tím hay laser và sự phát huỳnh quang này sẽ được ghi nhận bởi đầu đọc real-time của máy.