Giếng MK: Thang ADN chuẩn kích thước 50bp, giếng M13: Kích thước đoạn M13 trong vector pTZ57R/T, các giếng pOri, pRick lần lượt có khn là E.coli mang
plasmid pOri, pRick.
Bảng 3.2: Kết quả tạo plasmid chuẩn dƣơng real-time PCR cho vi khuẩn O. tsutsugamushi và Rickettsia
3.1.3. Đánh giá độ đặc hiệu của kĩ thuật real-time PCR.
Để phát triển kỹ thuật real-time PCR phát hiện O. tsutsugamushi chúng tôi sử dụng mồi ngược O.tsu108S-R3 và thiết kế bổ sung mồi xuôi O.tsu108S-F3 và probe O.tsu108S-Pro (trình tự mồi và probe thể hiện bảng 3.1), trong khi đó với Rickettsia mồi ngược là Rick.S-CS-R1 và thiết kế bổ sung mồi xi Rick.S-CS-F1 và Rick.S- CS-Pro1 (trình tự mồi và probe thể hiện bảng 3.1). Sơ đồ real-time PCR trình bày ở hình 3.3.
Plasmid Chiều dài (bps)
Nồng độ
(ng/µl) copies/µl pOri 3611 108 2.77E+10 pRick 3406 44 1.20E+10
Thành phần và chu trình nhiệt của real-time PCR như sau: 0.5 µl mỗi mồi, 0.5 µl probe, 10 µl Mastermix Qiagen và 5 µl ADN mẫu (thể tích cuối là 20 µl) với chu trình nhiệt là 95°C-15 phút, (95°C-15 giây, 60°C- 1 phút) lặp lại 45 chu kỳ.
Để đánh giá độ đặc hiệu của real-time PCR phát hiện O. tsutsugamushi và Rickettsia, 09 mẫu ADN tách từ 9 chủng vi khuẩn khác, 01 mẫu ADN tách từ máu
người khỏe mạnh, 02 mẫu ADN tách từ mẫu SM1604 và SM1608 và plasmid pOri và pRick được sử dụng trong các phản ứng real-time tương ứng. Kết quả thể hiện ở hình 3.8A cho thấy tín hiệu khuếch đại dương tính chỉ xuất hiện ở plasmid pRick và mẫu ADN từ bệnh phẩm SM1608, còn 9 mẫu ADN vi khuẩn và 1 mẫu ADN người khỏe mạnh cho kết quả âm tính. Tương tự ở hình 3.8B, tín hiệu khuếch đại dương tính cũng chỉ xuất hiện ở plasmid pOri và mẫu bệnh phẩm SM1604. Như vậy có thể khẳng real-time PCR trong cả hai trường hợp này có độ đặc hiệu 100%.