(A) Real-time PCR pOri. (B) Real-time PCR pRick
Trong nghiên cứu của Dong-Min Kim và cộng sự, khi so sánh PCR, nested PCR giữa các cặp mồi thiết kết ở gen 56kDa và 47kDa cho thấy khơng có sự khác biệt về độ nhạy và độ đặc hiệu, trong khi đó kỹ thuật real-time PCR thiết kế trên gen
47kDa cho ngưỡng phát hiện là 50 copies/µl [27]. Nghiên cứu của chúng tơi mồi và
probe được thiết kế trên vùng gene 56kDa đối với O. tsutsugamushi xác định được độ đặc hiệu và độ nhạy lần lượt là 100% và 20 copies/phản ứng.
Theo Liang và cộng sự, kết quả đánh giá độ nhạy của phản ứng real-time PCR phát hiện SFG với vùng gen đích ompA là 200 copies trên một phản ứng [35]. Một nghiên cứu khác của Jiang chỉ ra rằng real-time PCR dựa trên vùng gen đích ompB
hạn chế phát hiện chỉ một số loài trong chi Rickettsia và độ nhạy của phản ứng
trong nghiên cứu này là 10 copies/µl [23]. Trong khi đó, nghiên cứu của chúng tơi các mồi và probe đặc hiệu đều được thiết kế trên vùng gen gltA của các loài vi
khuẩn Rickettsia cho các phản ứng nested PCR cũng như real-time PCR. Kết quả
xác định độ đặc hiệu là 100% và độ nhạy là 4 copies/µl tương ứng với 20 copies trên một phản ứng. Đã có nhiều nghiên cứu trước đây về xây dựng kĩ thuật real-time PCR phát hiện Rickettsiaceae, tuy nhiên những nghiên cứu đó chủ yếu tập trung vào một số loài cụ thể và dựa vào việc nghiên cứu loài nào để lựa chọn vùng gen phù hợp. Rickettsiaceae là lồi vi khuẩn có hệ gen dễ bị biến đổi, vì vậy nghiên cứu
nhóm vi khuẩn này cần đánh giá hệ gen theo khu vực phân bố, chúng tôi lựa chọn gen 56kDa, gltA để nghiên cứu O. tsutsugamushi và Rickettsia theo phần lớn các
báo cáo trước đây trong khu vực. Hai vùng gen này cũng đã được đánh giá có tính đặc hiệu và bảo thủ cao. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, kĩ thuật real-time PCR phát hiện O. tsutsugamushi và Rickettsia cho kết quả độ đặc hiệu và độ nhạy cao.
3.2. Ứng dụng real-time PCR phát hiện Rickettsiaceae trên các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nghi ngờ
3.2.1. Một số đặc điểm của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Rickettsiaceae
Dựa trên các tiêu chuẩn như trên phần phương pháp đã đặt ra, có 87 bệnh nhân được lựa chọn trong nghiên cứu này của chúng tôi từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 9 năm 2017. Những bệnh nhân này có các biểu hiện lâm sàng nghi ngờ do nhiễm
Rickettsiaceae hoặc sốt chưa rõ nguyên nhân. Để hiểu rõ về dịch tễ học của bệnh,
chúng tôi đánh giá tỷ lệ bệnh nhân qua một số đặc điểm như giới tính, độ tuổi.
Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi và giới tính
Trong số 87 bệnh nhân nghiên cứu, có 59 bệnh nhân là nam chiếm tỷ lệ 67,82%; 28 bệnh nhân là nữ 32,18%. Trên hình 3.13 có thể thấy sự khác biệt rõ về tỷ lệ bệnh nhân nam và nữ, cụ thể tỷ lệ bệnh nhân nam nhiều hơn bệnh nhân nữ khoảng gấp hai lần. Tuổi trung bình của bệnh nhân trong nghiên cứu là 55,29 ± 14,16. Bệnh nhân ở nhóm tuổi 17-60, chiếm tỷ lệ cao nhất 62,07%; có 1 bệnh nhân là trẻ em 8 tuổi với tỷ lệ 1,15%; nhóm bệnh nhân trên 60 tuổi chiếm tỷ lệ tương đối
cao với 36,78% (Hình 3.14). Có thể thấy đối tượng có nguy cơ nhiễm bệnh ở tất cả các nhóm tuổi từ 19 – 92 tuổi, ít gặp ở nhóm dưới độ tuổi lao động.